產(chǎn)品簡介：

本產(chǎn)品是基于熒光染料檢測的即用型 RT-PCR 試劑盒，可以對靶 RNA 分子進行實時定量 RT-PCR 分析（quantitative RT-PCR、qRT-PCR）。產(chǎn)品含有經(jīng)過優(yōu)化的緩沖液組分、逆轉(zhuǎn)錄酶、熱啟動 Taq DNA 聚合酶、Taq DNA 穩(wěn)定劑、dNTPs、MgCl2和穩(wěn)定劑等所有染料法 qRT-PCR 所需要的成分，用戶只需加入 RNA 模板和引物即可進行染料法實時定量 RT-PCR 反應(yīng)，具有廣泛的用途。

產(chǎn)品特點：

1.即開即用，用戶只需準備模板、引物和 ROX 染料（取決于 qPCR 儀器）即可以進行染料法實時定量 RT-PCR 實驗，非常方便快捷，降低了操作誤差。

2.各成分的濃度和比例都經(jīng)過精心優(yōu)化，用戶不需要再優(yōu)化反應(yīng)。

3.反應(yīng)的靈敏度高，最高時可以達到 50 拷貝/反應(yīng)（跟模板質(zhì)量，引物設(shè)計等相關(guān)）。

4.靈敏度和專一性比常規(guī) RT-PCR 更高。

5.可用于基因表達分析、SNP 分析、拷貝數(shù)分析等實驗。

6.既可用于定性，也可用于定量。

7.本產(chǎn)品足夠 50 次 20uL 體系的染料法 qRT-PCR 反應(yīng)。

8.染料法qRT-PCR試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

成份規(guī)格包裝材料

2×染料法 qRT-PCR 緩沖液500 uL0.5mL 棕色管

10×染料法 qRT-PCR 酶混合液100 uL0.5mL 紅色蓋

使用手冊1 份無

運輸及保存

低溫運輸，-20℃保存, 不凍融時保存期限為 12 個月。如果需要每天使用，可在 4℃

放置三周。

自備試劑

RNA 模板、引物、超純水。

使用方法：

1. 如果有 N 個樣品并且做定量分析，最好設(shè)置 N+7 個反應(yīng)，多出的 7 個中，6 個是做標準曲線的陽性對照，一個是陰性對照（NC）。在 N+7 個 PCR 管中，加入下列成分。如果是做定性分析，則 6 個做標準曲線的樣品縮減成一個陽性對照

（PC），用戶自己需要根據(jù)下表進行適當(dāng)修改（把 6 個標曲反應(yīng)改成 1 個陽性對

照反應(yīng)）。

成分N 個樣品管6 個標準曲線管NC 管

2×染料法 qRT-PCR 緩沖液各 10 uL各 10 uL10 uL

自備引物 1（10uM）各 1 uL各 1 uL1 uL

自備引物 2（10uM）各 1 uL各 1 uL1 uL

N 個自備模板 RNA各 1-2 uL不加不加

自備陽性對照模板（6 個梯度）不加各 1 uL（1 管

加 1 個梯度）不加

陰性對照模板（水）不加不加1 uL

自備 50×ROX I 染料或

自備 50×ROX II 染料（見注）

各 0.4 uL

各 0.4 uL

0.4 uL

10×染料法 qRT-PCR 酶混合液2 uL2 uL2 uL

補超純水到20 uL20 uL20 uL

注，下列信息僅供參考，具體以 qPCR 儀器的使用手冊為準。

A、不需要 ROX 的機型：Agilent MX3000 和 MX4000、iCycler IQ、LightCycler 480、，、Smart Cycler System、Thermal Cycler Dice Real Time System 等型號的熒光 PCR 儀器不需要加 ROX 染料，但加入的話也不會影響整個 PCR 分析。

B、需要使用 ROX I 的機型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step One、Step One Plus。

C、需要使用 ROX II 的機型：ABI Prism7500、7500 Fast、MJ Opticon、 MJ Chromo4、Corbett RotorGene 3000。

2. 放入熒光 PCR 儀中進行擴增, 下表的擴增參數(shù)僅供參考，一定需要根據(jù)靶分子長度，引物的 Tm 值等進行調(diào)節(jié)。一般選擇三步法 PCR：

如果引物 Tm 值接近 60℃，也可以選擇兩步法 PCR：

步驟反應(yīng)參數(shù)備注

逆轉(zhuǎn)錄（RT 步驟）50℃ 30 分鐘

預(yù)變性94℃ 2 分鐘

PCR（35-45 次循環(huán)）94℃ 15 秒

60℃ 30-60 秒在此步采集 FAM 通道的熒光信號

3. 數(shù)據(jù)處理

如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的log 值，再推算出其濃度。

如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性。一般情況下，陰性對照 Ct 大于或等于 40（閾值需要以陰性對照的 Ct 值確定，此處為便于敘述以 40 為例， 具體情況很可能閾值不一樣）。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線， Ct 值應(yīng)該小于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。

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