產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

本產(chǎn)品是基于堿性磷酸酶的核酸去磷酸試劑盒。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.可以去除 DNA、RNA 和 dNTP 的磷酸基團(tuán)。

2.用于克隆載體去磷酸化時(shí)，可以有效防止載體自連。

3.可用于測(cè)序或 SNP 分析前除去 PCR 反應(yīng)中 dNTP 和焦磷酸鹽。

4.T4 PNK 標(biāo)記 5′ DNA 末端前，用來(lái)去除 DNA 靶分子的磷酸基團(tuán)。

5.模板可以是單鏈 DNA，也可以是雙鏈 DNA；既可以是平末端，也可以是 5′ 端突出或 3′端突出的粘性末端。

6.在幾乎所有限制性?xún)?nèi)切酶反應(yīng)緩沖液中均有活性，故可以跟限制性?xún)?nèi)切酶酶切  反應(yīng)同步進(jìn)行，減少操作步驟。

7.去磷酸化處理后的反應(yīng)液不需要純化，滅活酶后可直接用于后續(xù)的連接反應(yīng)和  標(biāo)記反應(yīng)。

8.65℃15 分鐘的熱處理可以使酶不可逆地徹-底滅活，不用擔(dān)心殘留的活性影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

9.本產(chǎn)品足夠 20 次 20 μL 體系的去磷酸化實(shí)驗(yàn)。

10.DNA去磷酸化試劑盒僅供科研使用。

產(chǎn)品參數(shù)：

成份規(guī)格包裝

10×去磷酸化緩沖液50 μL0.5 mL 藍(lán)蓋管

細(xì)菌堿性磷酸酶20 μL0.5 mL 紫蓋管

超純水1 mL1.5 mL 本色管

使用手冊(cè)1 份無(wú)

運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期為 12 個(gè)月。

自備試劑

DNA 片段

使用方法：

特別注意：

由于 dNTP 和 ATP 也是細(xì)菌堿性磷酸酶的底物，所以如果 DNA 溶液中含有大量的 dNTP（比如 PCR 產(chǎn)物中）或 ATP，而目的是去除 DNA 溶液的磷酸基團(tuán)， 最好先將其去除，否則它們會(huì)耗掉大量的細(xì)菌堿性磷酸酶活性，降低 DNA 去磷酸化效率。

一、去磷酸化反應(yīng)（以純化德 DNA 片段為例）

1、在微量離心管中配制下列反應(yīng)液（20 μL）：

成分用量

膠回收的 DNA 片段1 pmo（l 相當(dāng)于 1 ug 3Kb 的線(xiàn)狀質(zhì)粒）

10×去磷酸緩沖液2 μL

細(xì)菌堿性磷酸酶0.5 μL

超純水到20 μL

2、建議在 37℃反應(yīng) 30 分鐘（對(duì)平末端、5′端突出或 3′端突出的 DNA 片段均采用此保溫條件）。

3、65℃反應(yīng) 15 分鐘變性細(xì)菌堿性磷酸酶。

4、DNA 片段可以直接用于連接。

二、限制性酶切反應(yīng)中的同步去磷酸化

5、本細(xì)菌堿性磷酸酶在幾乎所有限制性?xún)?nèi)切酶的緩沖液中都有活性，故所以可以按 1 ug 3 Kb 長(zhǎng)度的 DNA 加 1 μL 細(xì)菌堿性磷酸酶的比例（對(duì)應(yīng)的是 DNA末端數(shù)量）直接加到限制性?xún)?nèi)切酶的反應(yīng)液中。反應(yīng)液中最好不含 dNTP 和ATP。

6、加熱滅活限制性?xún)?nèi)切酶和細(xì)菌堿性磷酸酶（滅活條件根據(jù)限制性?xún)?nèi)切酶不同而不同，但不能低于 65℃，時(shí)間不能短于 15 分鐘，否則不能滅活細(xì)菌堿性磷酸酶）。滅活后的樣品可以直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

7、如果不能采取加熱滅活限制性?xún)?nèi)切酶和細(xì)菌堿性磷酸酶，則需酚/氯仿抽提去除酶。具體操作如下(本試劑盒不提供相關(guān)試劑，需要從本公司另購(gòu)相關(guān)試劑，  下列操作僅供參考)：

附：酚/氯仿抽提去除酶步驟：

1、在反應(yīng)液中加入超純水使體積變成 100 μL，以免純化過(guò)程中 DNA 丟失。如果有必須，可以加入和 4 μL 核酸助沉劑提高回收效率。

2、加入 100 μL 酚/氯仿/異戊醇 25 ：24 ：1 混合液震蕩半分鐘混勻，室溫12000×g 心管中。離心 3 分鐘，轉(zhuǎn)移上清到新離心管中。

3、加 0.1 倍體積（即 10 μL）的 3 M 乙酸鈉溶液（pH 5.2）。

4、再加入 2.5 倍體積（即 250 μL）的無(wú)水乙醇。

5、混勻后 12000×g 4℃離心 10 分鐘，小心棄上清。

6、加入 1 mL 70%乙醇，短暫離心 3 分鐘后小心棄上清。

7、短暫離心 5 秒，吸棄殘留液體（約 30-50 μL）。

8、室溫放置 2 分鐘干燥后加入適量的超純水溶解 DNA，立即使用或放-20℃長(zhǎng)期保存。

選擇我們的DNA去磷酸化試劑盒，就是選擇精準(zhǔn)、高效、可靠的檢測(cè)方案，為您的科研實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航！