產(chǎn)品簡介：

MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白，Maltose Binding Protein）標(biāo)簽蛋白大小為 40 kDa，由大腸桿菌 K12 的 malE 基因編碼。MBP 可增加在細(xì)菌中過量表達(dá)的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。如果蛋白在細(xì)菌中表達(dá)，MBP 可以融合在蛋白的 N 端或 C 端。MBP 融合蛋白可通過交聯(lián)淀粉親和層析一步純化，結(jié)合的融合蛋白可用 10 mM 麥芽糖在生理緩沖液中進(jìn)行洗脫。如果要去除 MBP 融合部分，可用位點特異性蛋白酶切除?？捎?MBP 抗體或表達(dá)的目的蛋白特異性抗體檢測 MBP 標(biāo)簽標(biāo)記的重組蛋白。由于 MBP 融合蛋白原核表達(dá)載體具有表達(dá)效率高，易于純化等優(yōu)點。在現(xiàn)代分子克隆中 MBP 常作為融合蛋白被廣泛應(yīng)用。本產(chǎn)品就是專門用于分離純化 MBP 融合蛋白的試劑盒。

產(chǎn)品特點：

1.一站式套裝，含所需直鏈淀粉和瓊脂糖介質(zhì)、溶液和層析柱，操作非常方便。

2.提供 2 mL 直鏈淀粉-瓊脂糖介質(zhì)，最大載量為 10 mg MBP 蛋白/mL 介質(zhì)。

3.采用麥芽糖溫和洗脫，無去污劑和變性劑對蛋白活性的影響。

4.MBP 麥芽糖結(jié)合蛋白純化試劑盒可 20 次制備，但介質(zhì)可反復(fù)使用更多次(需要復(fù)活)，只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

成分規(guī)格包裝

直鏈淀粉-瓊脂糖介質(zhì)2 mL5 mL 本色瓶

1 M Tris-HCl（pH7.4）25 mL30 mL 本色瓶

0.1 M EDTA 溶液25 mL30 mL 本色瓶

2 M NaCl 溶液 50 mL60 mL 本色瓶

蔗糖20 g30 mL 本色瓶

PMSF（10 mg/mL）1 mL2.0 mL 白蓋管

0.1 mM 氯化鎂溶液50 mL60 mL 本色瓶

0.1 M 麥芽糖溶液25 mL30 mL 本色瓶

層析柱（6 mL）1 支1 袋

使用手冊1 份無

運輸及保存

常溫運輸和保存，但介質(zhì)需 4℃保存，PMSF 需要-20℃保存，有效期一年。

自備試劑

去離子水、20%乙醇、0.22 ?m 或 0.45 ?m 濾膜、自備透析袋（規(guī)格需小于

MBP 麥芽糖結(jié)合蛋白分子量）

使用方法：

1.將直鏈淀粉-瓊脂糖介質(zhì)充分混勻后，取適量加入到預(yù)放了一片篩板的層析柱中（介質(zhì)用量需要根據(jù) MBP 蛋白產(chǎn)量決定，其最大載量為 10 mg MBP 蛋白/mL 介質(zhì)，請根據(jù)實驗需要取適量的介質(zhì)加入層析柱中）。

2.用 5 倍柱體積（柱體積指的是填料介質(zhì)的體積，下同，本試劑盒介質(zhì)的體積是 2mL）自備去離子水洗柱，共 3 次。

3.用 5 倍柱體積（約 10 mL）的新配的結(jié)合緩沖液洗柱，進(jìn)行平衡，使填料介質(zhì)處于與目的蛋白相同的緩沖體系下，起到保護(hù)蛋白的作用。結(jié)合緩沖液的配方如下（以 10 mL 為例）：

4.4℃ 5000 g 離心 10 分鐘收集 20 mL 表達(dá)菌液，棄上清，將細(xì)胞沉淀（約100 mg）懸于 2 mL 冰冷的現(xiàn)配的細(xì)胞洗滌液中，4℃ 5000 g 離心 15 分鐘收集細(xì)胞沉淀后，再次懸于 2 mL 冰冷的細(xì)胞洗滌液中。（最好用不加誘導(dǎo)物的菌液做對照樣。）細(xì)胞洗滌液的配方如下（以 10 mL 為例）：

5.制備細(xì)胞裂解物：

1)如果所用載體不帶 MBP 信號肽序列（如pMAL-c2）

a)超聲破碎細(xì)胞，功率 30 W，保持細(xì)胞低溫（0℃），直到在顯微鏡下看見絕大多數(shù)細(xì)胞破裂。（超聲參數(shù)需根據(jù)儀器型號自行摸索， 但裂解物必須不粘稠，否則會堵塞層析柱。）

b)為使溶液澄清，向上述細(xì)胞洗滌液中加 35 ?L PMSF(10 mg/mL)。

c)4℃下 13000-15000 g 離心 30 分鐘，以去除殘留細(xì)胞和細(xì)胞碎片以防堵柱，收集上清樣品，留樣做 SDS-PAGE 電泳對照，其余樣品用于純化 MBP 融合蛋白，直接進(jìn)入第 6 步。

2)如果所用載體帶 MBP 信號肽序列（如pMAL-p2）

a)4℃ 5000 g 離心 15 分鐘收集細(xì)胞，沉淀懸于 1 mL 冰冷的現(xiàn)配的細(xì)胞裂解液中。細(xì)胞裂解液的配方如下（以 10 mL 為例）：

b)加入 25 ?L PMSF（10 mg/mL），室溫攪動 15 分鐘，于 4℃ 13000-15000 g 離心 10 分鐘收集細(xì)胞。

c)旋動細(xì)胞沉淀，加入 2 mL 冰冷的 0.1 mM MgCl2 溶液，4℃攪動10 分鐘。

d) 休克細(xì)胞 4℃ 13000-15000 g 離心 10 分鐘，在上清中加入 10

mM Tris-HCl（pH 7.4）（可將 1 M Tris-HCl，pH 7.4 稀釋 100

倍配制而成）至 pH 為 7.4。

e)上清用 0.22 ?m 水溶性濾膜過濾，濾液用 100 倍體積的 10 mM Tris-HCl（pH 7.4）（配方如上）使用自備透析袋 4℃透析，注：透析袋孔徑需根據(jù)蛋白大小決定，孔徑不得大于融合蛋白大小。

f)收集透析后樣品，留樣做 SDS-PAGE 電泳對照，其余樣品用于純化 MBP 融合蛋白，直接進(jìn)入第 6 步。

5.將樣品加到平衡好的直鏈淀粉-瓊脂糖介質(zhì)中，4℃搖床孵育至少 1 h（保證目的蛋白與介質(zhì)充分接觸，以提高目的蛋白的回收率），收集流出液。

6.用 10-15 倍柱體積的結(jié)合緩沖液（配方見上表）進(jìn)行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。

7.使用 5-10 倍柱體積的現(xiàn)配的麥芽糖洗脫液洗脫結(jié)合的融合蛋白，收集洗脫

液（即目的蛋白組分）。麥芽糖洗脫液的配方如下（以 10 mL 為例）： 成分用量在麥芽糖洗脫液中的濃度

1 M Tris-HCl（pH 7.4）0.2 mL20 mM

0.1 M EDTA 溶液0.1 mL1 mM

0.1 M 麥芽糖溶液1 mL10 mM

自備去離子水8.7 mL-

8.將純化得到的樣品（包括流出液、洗雜液和洗脫液）以及原始樣品使用

SDS-PAGE 檢測純化效果。

9.填料介質(zhì)清洗：依次使用 3 倍柱體積結(jié)合緩沖液和 5 倍柱體積去離子水平衡介質(zhì)，最后再用5 倍柱體積的20%的乙醇平衡，然后保存在等體積的20% 的乙醇中，置于 4℃保存，防止填料被細(xì)菌污染。本介質(zhì)可重復(fù)使用。

10.蛋白酶切割釋放靶蛋白（可選步驟，所用試劑需自備）：用適當(dāng)?shù)牡鞍酌盖懈钊诤系鞍揍尫虐械鞍住?/p>

1)加入自備的凝血-酶、腸激酶或 Xa 因子（根據(jù)融合蛋白中的位點選擇）。每毫升介質(zhì)中加入 50 單位的溶于 1 mL PBS 溶液的蛋白酶。顛倒離心管數(shù)次混勻，室溫下振蕩 2-16 小時。

2)4℃以 500 g 離心 5 分鐘，上清小心轉(zhuǎn)移到新離心管中。

3)用傳統(tǒng)的層析方法或 SDS-PAGE 電泳分離靶蛋白和蛋白酶。

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