丙酮酸脫氫酶（Pyruvate dehydrogenase，PDH）試劑盒說(shuō)明書

分光光度法 50 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

PDH（EC 1.2.4.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDHC)催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶，催化丙酮酸脫梭生成羥yi基-TPP，把糖酵解和三羧酸循環(huán)連接起來(lái)。

測(cè)定原理：

PDH 催化丙酮酸脫氫，同時(shí)還原 2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），從而導(dǎo)致 600nm 光吸收的減少。

丙酮酸脫氫酶試劑盒 三羧酸循環(huán)系列

組成：

工作液的配制：臨用前把試劑五、試劑六、試劑七和試劑八轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞，加入 1ml 試劑一和 10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、 將勻漿 600g，4℃離心 5min。

3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。

4、 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的 PDH（此步可選做）。

5、 在步驟④的沉淀中加入 200μl 試劑二和 2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于線粒體 PDH 活性測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 605nm 處，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）中孵育 5min。

3、在 1ml 玻璃比色皿中加入 50μl 樣本和 900μl 工作液，混勻，立即記錄 605nm 處初始吸光值 A1 和 1min后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

PDH 活性計(jì)算：

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。 PDH 活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=905×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

PDH 活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=182.8×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。 PDH 活性（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.366×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，9.5×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 ml；

V 樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

丙酮酸脫氫酶試劑盒 三羧酸循環(huán)系列