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BioRad酶標(biāo)儀熒光分析技術(shù)是一種強大的分析手段，廣泛地應(yīng)用在臨床檢驗、生物學(xué)研究、農(nóng)業(yè)科學(xué)、食品和環(huán)境科學(xué)中，是多功能酶標(biāo)儀的重要應(yīng)用，如TECAN(M1000、M200等)，Thmeral(Varioskan Flash)，Bio-tek（Synergy 4等），MD（M2、M5）都可以應(yīng)用于熒光檢測。

BioRad酶標(biāo)儀概述；
室溫下，大多數(shù)分子處于基態(tài)的低振動能級，處于基態(tài)的分子吸收能量（光能、化學(xué)能、電能或熱能）后躍遷至激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，將很快衰變到基態(tài)，以光的形式放出能量，這種現(xiàn)象稱為“發(fā)光現(xiàn)象”。分子發(fā)光包括熒光，磷光，化學(xué)發(fā)光，生物發(fā)光等。受到光照時發(fā)光，光照切斷時發(fā)光立即消失的叫熒光，光照切斷時，發(fā)光逐漸變?nèi)跻灾孪У慕辛坠?，吸收化學(xué)反應(yīng)的化學(xué)能量而發(fā)光叫化學(xué)發(fā)光，由生物能轉(zhuǎn)變?yōu)楣廨椛涞姆Q作生物發(fā)光。
由于發(fā)光物質(zhì)不同熒光有分子熒光和原子熒光之分，分子熒光為帶光譜，原子熒光為線光譜，通常所說的熒光為分子熒光。通過測定所發(fā)射熒光的特性和強度，可以對物質(zhì)進行定性、定量分析。

BioRad酶標(biāo)儀熒光檢測技術(shù)；
1熒光強度
熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度成正比，這是熒光分析法是量分析的依據(jù)。在生物學(xué)上的應(yīng)用非常廣泛，可以進行生物大分子定量，酶活性分析，熒光免疫分析，細(xì)胞學(xué)分析（細(xì)胞增殖，細(xì)胞毒理，細(xì)胞吸附等）和分子間相互作用。

1.1細(xì)胞凋亡檢測
Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小 亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase-3的活性明顯下降。
設(shè)計出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Z-DEVD-AMC。在共價偶聯(lián)時，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據(jù)釋放的AMC熒光強度的大小，可以測定 caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。

1.2細(xì)胞毒性的檢測
體外細(xì)胞毒性研究對于檢測新的生物來源或人工合成的細(xì)胞毒素以及例行的臨床相關(guān)的檢測都有著重要的意義。細(xì)胞膜非滲透性的核染料 Propidium iodide能穿透損傷的細(xì)胞膜，熒光密度越高反映出其受損細(xì)胞越多。

1.3鈣流檢測
Fura-2、indo-1、Quin-2是Ca2+熒光指示劑，可以靈敏地反映細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，當(dāng)結(jié)合鈣離子時，激發(fā)波長會發(fā)生改變，發(fā)射熒光的強度和結(jié)合的Ca2+濃度有著定量的關(guān)系。

2.熒光偏振(FP)
1926年P(guān)errin首先描述了熒光偏振理論，溶液中的熒光分子在受到偏振光照射時，可吸收并釋放出相應(yīng)的偏振熒光，如果在激發(fā)時熒光物質(zhì)處于靜止?fàn)顟B(tài)，發(fā)射光將保持原有激發(fā)光的偏振性，如果其處于運動狀態(tài)，發(fā)射光電偏振偏振平面將不同于原有激發(fā)光的偏振特性，這就是熒光偏振現(xiàn)象，熒光分子與其它因子的相互作用，例如相互結(jié)合或排斥；其所處環(huán)境的性質(zhì)，例如溶液的粘度、溫度等，這些因素都有可能對這個熒光因子受激發(fā)后發(fā)出的發(fā)射光的發(fā)射平面產(chǎn)生影響。因此以熒光偏振為基礎(chǔ)發(fā)展的技術(shù)可用來研究生命科學(xué)中分子之間的相互作用，如受體配體結(jié)合分析，DNA－蛋白質(zhì)結(jié)合分析，SNP分析，酶活性分析。

熒光偏振分析所需的樣品量少，靈敏度高，可達亞納摩爾級范圍，重復(fù)性好，操作簡便，也更為安全可靠，不會在實驗過程中生成有害的放射性**，此外熒光偏振是真正均相的，允許實時檢測（動力學(xué)檢測），對于濃度變化不敏感，是均相檢測形式（中間不含洗滌步驟）的解決方案。

酶標(biāo)儀實際上就是一臺變相光電比色計或分光光度計，其基本工作原理與主要結(jié)構(gòu)和光電比色計基本相同. 圖示是一種單通道自動進樣的酶標(biāo)儀工作原理圖.光源燈發(fā)出的光波經(jīng)過濾光片或單色器變成一束單色光，進入塑料微孔極中的待測標(biāo)本.該單色光一部分被標(biāo)本吸收，另一部分則透過標(biāo)本照射到光電檢測器上，光電檢測器將這一待測標(biāo)本不同而強弱不同的光信號轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的電信號.電信號經(jīng)前置放大，對數(shù)放大，模數(shù)轉(zhuǎn)換等信號處理后送入微處理器進行數(shù)據(jù)處理和計算，后由顯示器和打印機顯示結(jié)果. 微處理機還通過控制電路控制機械驅(qū)動機構(gòu)X方向和Y方向的運動來移動微孔板，從而實現(xiàn)自動進樣檢測過程.而另一些酶標(biāo)儀則是采用手工移動微孔板進行檢測，因此省去了X,Y方向的機械驅(qū)動機構(gòu)和控制電路，從而使儀器更小巧，結(jié)構(gòu)也更簡單.

Bio-Rad酶標(biāo)儀：即酶聯(lián)免疫檢測儀（ELISA Reader）是酶聯(lián)免疫吸附試驗的儀器。可簡單地分為半自動和全自動2大類，但其工作原理基本上都是一致的，其核心都是一個比色計，即用比色法來分析抗原或抗體的含量。ELISA測定一般要求測試液的終體積在250ul以下，用一般光電比色計無法完成測試，因此對酶標(biāo)儀中的光電比色計有特殊要求。

Bio-Rad酶標(biāo)法的基本原理是將抗原或抗體與酶用膠聯(lián)劑結(jié)合為酶標(biāo)抗原或抗體，此酶標(biāo)抗原或抗體可與固相載體上或組織內(nèi)相應(yīng)抗原或抗體發(fā)生特異反應(yīng)，并牢固地結(jié)合形成仍保持活性的免疫復(fù)合物。當(dāng)加入相應(yīng)底物時，底物被酶催化而呈現(xiàn)出相應(yīng)反應(yīng)顏色。顏色深淺與相應(yīng)抗原或抗體含量成正比。由于此技術(shù)是建立在抗原-抗體反應(yīng)和酶的高效催化作用的基礎(chǔ)上，因此，具有高度的靈敏性和特異性，是一種極富生命力的免疫學(xué)試驗技術(shù)。

Bio-Rad酶標(biāo)儀所用的單色光既可通過相干濾光片來獲得，也可用分光光度計相同的單色器來得到。在使用濾光片作濾波裝置時與普通比色計一樣，濾光片即可放在微孔板的前面，也可放在微孔板的后面，其效果是相同的。光源燈發(fā)出的光經(jīng)聚光鏡，光欄后到達反射鏡，經(jīng)反射鏡作90o反射后垂直通過比色溶液，然后再經(jīng)濾光片送到光電管。

Bio-Rad酶標(biāo)儀和普通的光電比色計有以下幾點差異：
(l)盛裝待測比色液的容器不再使用比色皿，而是使用塑料微孔板。微孔板常用透明的聚乙烯材料制成，對抗原抗體有較強的吸附作用，故用它作為固相載體。
(2)由于盛樣本的塑料微孔板是多排多孔的，光線只能垂直穿過，因此酶標(biāo)儀的光來都是垂直通過待測溶液和微孔板的，光束既可是從上到下，也可以是從下到上穿過比色液。
(3)酶標(biāo)儀通常不僅用A，有時也使用光密度OD來表示吸光度。

Bio-Rad酶標(biāo)儀可分為單通道和多通道2種類型，單通道又有自動和手動2種之分。自動型的儀器有X，Y方向的機械驅(qū)動機構(gòu)，可將微孔板L的小孔一個個依次送入光束下面測試，手動型則靠手工移動微孔板來進行測量。在單通道酶標(biāo)儀的基礎(chǔ)上又發(fā)展了多通道酶標(biāo)僅，此類酶標(biāo)僅一般都是自動化型的。它設(shè)有多個光束和多個光電檢測器，如12個通道的儀器設(shè)有12條光束或12個光，12個檢測器和12個放大器，在X方向的機械驅(qū)動裝置的作用下，樣品12個為一排被檢測。多通道酶標(biāo)儀的檢測速度快，但其結(jié)構(gòu)較復(fù)雜價格也較高。

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