細(xì)胞凋亡或稱程序性細(xì)胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是細(xì)胞的生命現(xiàn)象之一，它在機體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)及自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的清除等方面起著十分重要的作用。細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的失控可導(dǎo)致臨床各種疾病的發(fā)生。如老年性癡呆與神經(jīng)細(xì)胞凋亡過度有關(guān)，自身免疫性疾病和腫瘤與細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。細(xì)胞凋亡有別于細(xì)胞壞死，它有一系列的細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)的改變，包括出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、DNA降解、凋亡小體形成等。在正常的活細(xì)胞，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine， PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在凋亡的細(xì)胞，PS 從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca²⁺ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。因此將Annexin-Ⅴ進(jìn)行熒光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-Ⅴ作為探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

實驗步驟

1.  凋亡細(xì)胞的制備
小鼠腹腔注射地塞米松25 mg/kg體重，10 h后解剖取胸腺，分離胸腺細(xì)胞。用PBS洗兩遍，調(diào)整待測細(xì)胞的濃度為2×10⁶ /ml，備用。

2.  200 μl細(xì)胞懸液加入1 ml冷PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，1000 rpm 4 ℃離心10 分鐘，棄上清。

3.  重復(fù)步驟2兩次。

4.  將細(xì)胞重懸于200 μl 標(biāo)記緩沖液。

注意事項

1.  整個操作過程動作要盡量輕柔，切勿用力吹打細(xì)胞，盡量在4 ℃下操作。

2.  反應(yīng)完畢后要盡快檢測，因為細(xì)胞凋亡是一個動態(tài)的過程，反應(yīng)一小時后熒光強度就開始衰變。

3.  Annexin V-FITC是光敏物質(zhì)，在操作時要注意避光。