熒光原位雜交技術(shù)fish檢測FFPE組織中miRNAs有很多優(yōu)勢，可以使miRNAs在復(fù)雜組織中的確定位置形象化地體現(xiàn)，可以進(jìn)行大量樣本的檢測
熒光原位雜交技術(shù)fish檢測的詳細(xì)介紹：
熒光原位雜交(FISH)技術(shù)檢測組織中的DNA或RNA序列，那他能不能檢測microRNAs呢？提到miRNAs，我們首先想到的是他們非常小，確實(shí)它們是很短的單鏈RNA分子，只有18-23個(gè)核苷酸。由于他們很小，所以對FISH技術(shù)的可行性有很多擔(dān)憂，比如探針能否具有足夠的敏感性和特異性，什么樣的探測系統(tǒng)適合于來自這些短的目標(biāo)序列的信號(hào)等等。
miRNAs在FFPE組織中的完整性
很有趣的是，研究表明相比于mRNAs, miRNAs在福爾馬林固定的石蠟包埋組織(FFPE)中能夠更好地保存。正是因?yàn)樗麄兊捏w積小, 可以和大的蛋白復(fù)合物緊密結(jié)合，使得它們能夠忍受這個(gè)過程。不過，需要一直保持沒有RNAse污染的環(huán)境，經(jīng)常我們會(huì)使用DEPC水來準(zhǔn)備溶液。當(dāng)然，實(shí)驗(yàn)需要的任何器具都需要提前進(jìn)行高壓滅菌。
熒光原位雜交技術(shù)fish檢測抗原修復(fù)
經(jīng)過福爾馬林固定交聯(lián)會(huì)限制探針和試劑，使它們不能接近目的miRNAs，可以用抗原修復(fù)術(shù)來暴露這些位點(diǎn)。大多數(shù)protocols會(huì)使用含有蛋白酶K的 tris緩沖液中來打破甲醛交聯(lián)，也有一些報(bào)告，蛋白酶K可能會(huì)破壞一些抗原表位，建議在檸檬酸緩沖中加熱樣本。這兩種方法都會(huì)有效, 可以探索哪種更適合自己的樣本。
熒光原位雜交技術(shù)fish檢測探針選擇
曾經(jīng)有人探索使用標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行miRNAs的FISH實(shí)驗(yàn)，但由于目標(biāo)序列太短，雙鏈穩(wěn)定性差，而且與緊鄰的相關(guān)miRNAs有很高的序列相似性，使得很難達(dá)到足夠的特異性?，F(xiàn)在我們通常使用表現(xiàn)更好的Locked DNA(LNA)探針來實(shí)現(xiàn)這一過程。
Locked DNA是一類DNA類似物，糖環(huán)上被鎖定在一個(gè)亞甲基橋，使得探針在N構(gòu)象穩(wěn)定，因此LNA探針是結(jié)合的佳選擇， 它們在更高的溫度下實(shí)現(xiàn)更高的親和力和穩(wěn)定性。*匹配的雙鏈和錯(cuò)配之間所需溫度不同，所以更容易找到一個(gè)雜交溫度可以只檢測的*匹配,而且，LNA/miRNA雜交體可以抵抗核酸酶的攻擊。
對照探針
確保使用陽性和陰性對照探針,特別是設(shè)置程序時(shí)。陽性對照是檢測存在于特定組織中的miRNA，陰性對照設(shè)置兩個(gè)探針，其中一個(gè)含有兩處錯(cuò)配，另一個(gè)是針對你所要檢測的組織中已知的不會(huì)表達(dá)的miRNA具有特異性。如果你難以區(qū)分背景噪音的信號(hào),你應(yīng)該還設(shè)置一個(gè)‘no probe’對照.
熒光原位雜交技術(shù)fish檢測雜交和洗滌
先在50°C進(jìn)行兩個(gè)小時(shí)的預(yù)雜交，然后再與探針進(jìn)行雜交過夜，溫度也是在50°C. 之后進(jìn)行嚴(yán)格的洗滌步驟，這是去除非特異性反應(yīng)的關(guān)鍵步驟。洗滌是在SSC緩沖液中，先是在37°C進(jìn)行洗滌, 以去除多余的探針和雜交緩沖液，然后在50°C進(jìn)行振蕩洗滌，以消除非特異性和重復(fù)性的雜交。如果非特異性結(jié)合仍然是一個(gè)問題,試著重復(fù)洗幾次。如果你剛剛開始實(shí)驗(yàn)，可以探索下不同的雜交和洗滌溫度，可能上下兩度的的差異會(huì)帶來很大的不同。
熒光原位雜交技術(shù)fish檢測探針標(biāo)記和信號(hào)檢測
市場上有很多種寡核苷酸標(biāo)記示蹤劑以供選擇。生物素被用作5’端耦合，適合進(jìn)行免疫組化檢測。如果你的組織是豐富的內(nèi)源性生物素,dioxigenin應(yīng)該是你的*選擇。結(jié)合anti-label抗體后,用辣根過氧化物酶系統(tǒng)將信號(hào)放大。還可以選擇一個(gè)合適的熒光基團(tuán)為HRP底物，常使用的是花青染料, Alexa系列或Quasar染料也是一種選擇。根據(jù)所需的ex/em，雙標(biāo)等選擇合適的標(biāo)記。
熒光原位雜交技術(shù)fish檢測FFPE組織中miRNAs有很多優(yōu)勢，可以使miRNAs在復(fù)雜組織中的確定位置形象化地體現(xiàn)，可以進(jìn)行大量樣本的檢測。隨著科學(xué)發(fā)展，還可以同時(shí)檢測蛋白質(zhì)標(biāo)記的miRNA,以及多元miRNA FISH技術(shù)。無論在癌癥領(lǐng)域還是發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域，miRNA研究都是具有無限潛力的！
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