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果膠酯酶（pectinesterase，PE）試劑盒說明書
閱讀：282 發(fā)布時(shí)間：2023-9-8本試劑盒僅供科研使用
果膠酯酶（pectinesterase，PE）試劑盒說明書
（貨號：WS7070D 48樣）
一、產(chǎn)品簡介： 果膠酯酶，屬果膠酶系，亦稱果膠甲酯酶、果膠氧化酶。催化水解果膠長鏈上的甲氧酯水解產(chǎn)生小分子 物質(zhì)果膠酸和甲醇, 從而增加果膠在水中的溶解度。廣泛存在于高等植物和可以降解細(xì)胞壁的細(xì)菌和真菌 中，起內(nèi)源調(diào)控植物細(xì)胞壁上及細(xì)胞之間果膠含量的作用。 果膠酯酶（PE）催化水解果膠分子釋放H+，使反應(yīng)體系的pH下降，用堿液維持體系的pH始終保持在7.8(酚 酞指示劑維持在粉紅色)，通過堿消耗的NaOH 量反映果膠酯酶的活性。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 80mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前加 12.5mL 蒸餾水于試劑瓶（50℃加熱溶 解），冷卻后轉(zhuǎn)入 250mL 容量瓶，并定容至 250mL。 試劑二 粉劑 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 1.5mL 乙醇溶 解備用。 試劑三 液體 15mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 液體 25mL×1 瓶 4℃保存 三、所需儀器和用品： 天平、研缽、離心機(jī)、水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱。 四、果膠酯酶（PE）的測定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：取 0.5g 組織樣品（葉片類樣本可取 0.15g），加 1.5mL 提取液冰浴研磨， 12000rpm、4℃離心 15min，取全部上清液待測。 【注】：若酶活力太高，可降低樣本取樣質(zhì)量W或?qū)⑸锨逡合♂?/span>2-5倍后再進(jìn)行測定，并在計(jì)算公式 中乘以稀釋倍數(shù)D。 ② 細(xì)菌/培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌或 細(xì)胞加入 1.5mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為 500：1 的比例進(jìn)行提取。 2、上機(jī)檢測： ① 試劑一于37℃烘箱保溫10min。 ② 取出1mL的上清液轉(zhuǎn)移至離心管或試管中。 ③ 向離心管或試管中依次加25μL 試劑二，4mL試劑一，混勻，并用試劑三調(diào)pH至7.8（粉 紅色）。 ④ 將離心管或試管于37℃（水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱）孵育60min。每隔20分鐘用試劑四調(diào) 節(jié)pH，使其維持在7.8（粉紅色）。同時(shí)記錄所消耗的試劑四的體積V2（mL）。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按照樣本質(zhì)量計(jì)算： 酶活定義：每克組織每小時(shí)消耗1μmol NaOH 定義為一個(gè)酶活單位U。 PE 活性(μmoL/min/g)=20×V2÷(V1÷V×W) ÷T×D =30×V2÷W×D 2、按照蛋白濃度計(jì)算：本試劑盒僅供科研使用 2 酶活定義：每毫克蛋白每小時(shí)消耗1μmol NaOH 定義為一個(gè)酶活單位U。 PE 活性(μmoL/min/mg prot)=20×V2÷(V1÷V×Cpr)÷T×D =30×V2÷Cpr×D 3、按細(xì)菌/細(xì)胞密度計(jì)算： 酶活定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每小時(shí)消耗 1μmol NaOH 定義為一個(gè)酶活單位 U。 PE 活性(μmoL/min/104 cell)=20×V2÷(V1÷V×500)÷T×D =0.06×V2×D V1---加入離心管或試管中的上清液體積，1mL； V---提取液體積，1.5mL； V2---滴定所消耗的試劑四的量，mL； T---反應(yīng)時(shí)間，60 min=1h； D---樣品稀釋倍數(shù)； W---樣品質(zhì)量，g；20---試劑四的NaOH 濃度，20μmol/mL； 500---細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬； Cpr----上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。