1. 快速內(nèi)切酶SpeI DNA 快速酶切流程：
① 在冰上按如下建議的加樣順序配制反應(yīng)體系：
| 質(zhì)粒 DNA | PCR 產(chǎn)物 | 基因組 DNA |
| ddH2O | 15 μl | 16 μl | 30 μl |
| 10× Cut Buffer 或 10× Cut Color Buffer | 2 μl | 3 μl（a） | 5 μl |
| 底物 DNA | 2 μl (up to 1 μg) | 10 μl (~0.2 μg) | 10 μl (5 μg) |
| Spel | 1 μl | 1 μl | 5 μl |
| Total | 20 μl | 30 μl | 50 μl |
a. 本體系適用于經(jīng)過(guò)純化的 PCR 產(chǎn)物酶切。未純化的 PCR 產(chǎn)物具備一定的離子強(qiáng)度，10× Cut Buffer 加入量可適當(dāng)減少至 2 μl。但由于 DNA 聚合酶同時(shí)具有外切酶活性，會(huì)影響酶切產(chǎn)物，因此如下一步需進(jìn)行克隆等操作，建議酶切前對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化。
② 輕柔吸打或輕彈管壁以混勻（切勿渦旋），然后瞬時(shí)離心以收集掛壁液滴；
③ 37℃溫育 15 min（質(zhì)粒），或 15~30 min（PCR 產(chǎn)物），或 30~60 min（基因組 DNA）；
④ 80℃溫育 20 min 即可使酶失活，停止反應(yīng)（可選）。
2. 雙酶切或多酶切：
① 每種快速內(nèi)切酶的用量為 1 μl，并根據(jù)需要適當(dāng)擴(kuò)大反應(yīng)體系；
② 所有快速內(nèi)切酶的體積總和不得超過(guò)總反應(yīng)體系的 1/10；
③ 如果所用的幾種快速內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同，應(yīng)先以最適溫度低的酶開(kāi)始酶切，再添加最適溫度較高的酶，在其最適反應(yīng)溫度下進(jìn)行酶切反應(yīng)。
3. 適用于質(zhì)粒的擴(kuò)大反應(yīng)體系：
| DNA | 1 μg | 2 μg | 3μg | 4 μg | 5 μg |
| Spel | 1 μl | 2μl | 3 μl | 4 μl | 5 μl |
| 10× Cut Buffer 或 10× Cut Color Buffer | 2 μl | 2 μl | 3 μl | 4 μl | 5 μl |
| Total | 20 μl | 20 μl | 30 μl | 40 μl | 50 μl |
注：如果總反應(yīng)體系大于 20 μl，應(yīng)適當(dāng)增加溫育時(shí)間，盡量使用水浴、金屬浴或沙浴。
不同 DNA 中的酶切位點(diǎn)數(shù)量：
| λDNA | ΦX174 | pBR322 | pUC57 | pUC18/19 | SV40 | M13mp18/19 | Adeno2 |
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 |
甲基化修飾影響：
| Dam | Dcm | CpG | EcoKI | EcoBI |
| 無(wú)影響 | 無(wú)影響 | 無(wú)影響 | 序列可能重疊
剪切可能受影響 | 序列可能重疊
剪切可能受影響 |
在不同反應(yīng)緩沖液中的活性：
| Cut Buffer | Thermo Scientific
FastDigest Buffer | NEB
CutSmart®
Buffer | Takara
QuickCut™ Buffer |
| 活性 | 100% | 100% | 100% | 100% |
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