1. 快速內切酶DpnIDNA 快速酶切流程:
① 在冰上按如下建議的加樣順序配制反應體系:
| 質粒 DNA | 基因組 DNA |
ddH2O | 15 μl | 30 μl |
10× Cut Buffer 或 10× Cut Color Buffer | 2 μl | 5 μl |
底物 DNA | 2 μl (up to 1 μg) | 10 μl (5 μg) |
DpnI | 1 μl | 5 μl |
Total | 20 μl | 50 μl |
② 輕柔吸打或輕彈管壁以混勻(切勿渦旋),然后瞬時離心以收集掛壁液滴;
③ 37℃溫育 15 min(質粒),或 30~60 min(基因組 DNA);
④ 80℃溫育 20 min 即可使酶失活,停止反應(可選)。
2. 雙酶切或多酶切:
① 每種快速內切酶的用量為 1 μl,并根據需要適當擴大反應體系;
② 所有快速內切酶的體積總和不得超過總反應體系的 1/10;
③ 如果所用的幾種快速內切酶的最適反應溫度不同,應先以最適溫度低的酶開始酶切,再添加最適溫度較高的酶,在其最適反應溫度下進行酶切反應。
3. 適用于質粒的擴大反應體系:
DNA | 1 μg | 2 μg | 3μg | 4 μg | 5 μg |
DpnI | 1 μl | 2μl | 3 μl | 4 μl | 5 μl |
10× Cut Buffer 或 10× Cut Color Buffer | 2 μl | 2 μl | 3 μl | 4 μl | 5 μl |
Total | 20 μl | 20 μl | 30 μl | 40 μl | 50 μl |
注:如果總反應體系大于 20 μl,應適當增加溫育時間,盡量使用水浴、金屬浴或沙浴。
不同 DNA 中的酶切位點數量:
λDNA | ΦX174 | pBR322 | pUC57 | pUC18/19 | SV40 | M13mp18/19 | Adeno2 |
116 | 0 | 22 | 15 | 15 | 8 | 7 | 87 |
甲基化修飾影響:
Dam | Dcm | CpG | EcoKI | EcoBI |
不能切割Dam-DNA | 無影響 | 無影響 | 無影響 | 序列可能重疊 剪切可能受影響 |
在不同反應緩沖液中的活性:
| Cut Buffer | Thermo Scientific FastDigest Buffer | NEB CutSmart® Buffer | Takara QuickCut™ Buffer |
活性 | 100% | 100% | 100% | 100% |