流程

類器官原代培養(yǎng)流程

原代

一、準(zhǔn)備工作

1、儀器設(shè)備

CO₂培養(yǎng)箱、雙人單面超凈臺(tái)、倒置顯微鏡、臺(tái)式冷凍離心機(jī)、水浴鍋(abs72023)或水浴搖床，醫(yī)用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪、眼科鑷

2、試劑耗材（以腸癌為例）

動(dòng)物腦類器官培養(yǎng)基試劑盒(abs90050)，基質(zhì)膠（低因子、無酚紅）(abs9495)，60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(abs7005)， 100μm濾篩(abs7009)，15mL離心管(abs7102)，1.5mL EP管若干(abs7119)，24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(abs7035)、金屬冰盒、眼科剪刀、眼科鑷

二、操作流程

1、樣本準(zhǔn)備

（1）將組織放入含有預(yù)冷的(2-8°C)組織保存液E的取樣瓶中（浸沒整個(gè)組織），4℃從醫(yī)院/實(shí)驗(yàn)室取回；

（2）將取樣瓶消毒，組織取出放入培養(yǎng)皿樣本拍照，并登記，大小，顏色，軟硬程度，組織類型等信息。

2、清洗-剪碎

（1）在60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(abs7005)里用2-3mL原代培養(yǎng)緩沖液B浸泡。用原代培養(yǎng)緩沖液B清洗三次（每次更換培養(yǎng)皿）后剪碎，剪成大約1-3mm³的組織塊，轉(zhuǎn)移至15mL離心管。

3、消化-過濾

（1）向15mL離心管中加入5倍原代組織消化液C（消化液體積：組織體積=5:1，如果估量組織體積困難，使用5mL消化液通常足夠）在37℃進(jìn)行消化15-30min（消化過程中隨時(shí)觀察消化情況）。

（2）取少量液體在顯微鏡下觀察，鏡下觀察到較多的細(xì)胞團(tuán)（5-50個(gè)細(xì)胞抱團(tuán)）后， 加入3倍體積原代培養(yǎng)緩沖液B（緩沖液體積：消化液體積=3:1）終止消化，用槍頭輕柔吹打可以看到液體變渾濁。

（3）使用100μm濾篩(abs7009)進(jìn)行過濾，取少量濾液在鏡下進(jìn)行觀察。將濾液收集到15mL離心管，于300g 4℃富集離心5min后移去上清。

4、加膠-點(diǎn)板-加液（這里是整個(gè)原代操作的點(diǎn)睛之筆）

（1）準(zhǔn)備工作

a 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

b 槍頭、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí)；

c 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存，建議2周內(nèi)用完。

低溫金屬冰盒(abs7289)

（2）接種要求

24孔板(abs7035)，每孔25uL基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混合物，500-750uL類器官培養(yǎng)液。

（3）接種密度

密度建議1：基質(zhì)膠體積：細(xì)胞團(tuán)沉淀體積=25:1（如果估摸細(xì)胞團(tuán)沉淀體積困難，通常加300uL基質(zhì)膠足夠）

密度建議2：500個(gè)細(xì)胞團(tuán)/25uL基質(zhì)膠（如果想計(jì)數(shù)接種，可以參照此密度建議）

（4）加膠-點(diǎn)板

向細(xì)胞團(tuán)沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495)，進(jìn)行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡），然后進(jìn)行點(diǎn)板。整個(gè)操作在金屬冰盒或冰上進(jìn)行。操作熟練以后，加膠，混勻，點(diǎn)板控制在半分鐘內(nèi)，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性。

（5）加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μL類器官培養(yǎng)基A進(jìn)行培養(yǎng)。大概10-14天，多數(shù)類器官直徑在200um-500um，可進(jìn)行傳代操作。

鋪板密度

傳代（消化分兩種情況）

一、類器官數(shù)量較多或體積較大傳代步驟

1、類器官收集及洗滌

（1）收集：移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G，輕柔吹散基質(zhì)膠，收集在15mL離心管中（24孔板，每5孔為一組）。

（2）洗滌：加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多，基質(zhì)膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化，如果冰箱保溫效果強(qiáng)，縮短冷凍時(shí)間，摸索合適的冷凍時(shí)間時(shí)，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說明冷化好了）。

（3）接下來將離心管進(jìn)行300g，4℃，離心5min，離心完通常會(huì)有這兩種情況：

第一種是正常情況，分成三層（如下圖），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。

第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關(guān)。此時(shí)棄掉緩沖液，留下基質(zhì)膠類器官混懸液，重復(fù)上一步洗滌步驟，再次冷化離心，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層、基質(zhì)膠層、類器官沉淀層），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠類器官混懸液層），此時(shí)棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠類器官混懸液，保留下2/3即可。

促進(jìn)基質(zhì)膠和類器官有效分離條件：

a 離心機(jī)的選擇非常重要，水平角離心機(jī)相比固定角離心機(jī)更利于基質(zhì)膠和類器官分離；

b 離心機(jī)的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化），離心轉(zhuǎn)速可適當(dāng)提高（最高不要超過500g），離心時(shí)間可適當(dāng)加長(zhǎng)（最常不超過10min）。

2、類器官消化

（1）添加2-3mL類器官傳代消化液D于超凈臺(tái)內(nèi)消化2-3min，消化期間吹打1-2次。此步驟以消化成細(xì)胞團(tuán)為主，千萬不要消化成單細(xì)胞，單細(xì)胞類器官存活率低。如果不確定是否消化適宜，可吸取數(shù)微升鏡下觀察，如果有較多細(xì)胞團(tuán)可停止消化。

（2）添加5倍類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G（緩沖液：消化液=5:1）終止消化，300g 4℃離心5min棄去上清（如果有基質(zhì)膠殘留，殘留量<50uL正常，不影響傳代類器官增殖）

3、加膠-點(diǎn)板-加液

（1）準(zhǔn)備工作

a 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

b 槍頭、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí)；

c 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存，建議2周內(nèi)用完。

（2）接種要求

24孔板(abs7035)，每孔25uL基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混合物，500-750uL類器官培養(yǎng)液。

（3）接種密度

密度建議1： 類器官通常按1:2傳代，例如，24孔板收集5孔，傳代10孔，需要的基質(zhì)膠量25*10=250uL

密度建議2：500個(gè)細(xì)胞團(tuán)/25uL基質(zhì)膠（如果想計(jì)數(shù)接種，可以參照此密度建議）

注意：不管是按密度建議1還是，密度建議2，如果有殘留的基質(zhì)膠，新膠量至少是殘留膠量的1.5倍。

（4）加膠-點(diǎn)板

向細(xì)胞團(tuán)沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495)，進(jìn)行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡），然后進(jìn)行點(diǎn)板。整個(gè)操作在金屬冰盒或冰上進(jìn)行。操作熟練以后，加膠，混勻，點(diǎn)板控制在半分鐘內(nèi)，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性。

（5）加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μL人腸癌類器官培養(yǎng)基A進(jìn)行培養(yǎng)。大概10-14天，多數(shù)類器官直徑在200-300um，可進(jìn)行傳代操作。

二、類器官數(shù)量不足或體積較小時(shí)：

1、類器官收集、吹打、洗滌

（1）移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G，輕柔吹散基質(zhì)膠；

（2）進(jìn)行吹打，將類器官吹成細(xì)胞團(tuán)（可取樣鏡下觀察有較多細(xì)胞團(tuán)時(shí)可停止吹打）；

（3）洗滌： 24孔板，每5孔為一組，收集在15mL離心管中，加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多，基質(zhì)膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化，如果冰箱保溫效果強(qiáng)，縮短冷凍時(shí)間，摸索合適的冷凍時(shí)間時(shí)，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說明冷化好了）；

（4）接下來將離心管進(jìn)行300g，4℃，離心5min，離心完通常會(huì)有這兩種情況：

第一種是正常情況，分成三層（如下圖），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留細(xì)胞團(tuán)沉淀即可。

第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關(guān)。此時(shí)棄掉緩沖液，留下基質(zhì)膠類器官混懸液，重復(fù)上一步洗滌步驟，再次冷化離心，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層、基質(zhì)膠層、類器官沉淀層），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混懸液層），此時(shí)棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混懸液，保留下2/3即可。

促進(jìn)基質(zhì)膠和類器官有效分離條件：

a 離心機(jī)的選擇非常重要，水平角離心機(jī)相比固定角離心機(jī)更利于基質(zhì)膠和類器官分離；

b 離心機(jī)的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化），離心轉(zhuǎn)速可適當(dāng)提高（最高不要超過500g），離心時(shí)間可適當(dāng)加長(zhǎng)（最常不超過10min）。

2、加膠-點(diǎn)板-加液

（1）準(zhǔn)備工作

a 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

b 槍頭、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí)；

c 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存，建議2周內(nèi)用完。

（2）接種要求

24孔板(abs7035)，每孔25uL基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混合物，500-750uL類器官培養(yǎng)液。

（3）接種密度

密度建議1： 對(duì)于類器官數(shù)量較少的情況，為了維持生長(zhǎng)所需的旁分泌信號(hào)，需要2-3孔富集到1孔，例如，24孔板收集6孔，2孔富集1孔，鋪3孔，需要的基質(zhì)膠量25*3=75uL。

密度建議2：500個(gè)細(xì)胞團(tuán)/25uL基質(zhì)膠（如果想計(jì)數(shù)接種，可以參照此密度建議）

注意：不管是按密度建議1還是按密度建議2，如果有殘留的基質(zhì)膠，新膠量至少是殘留膠量的1.5倍

（4）加膠-點(diǎn)板

向細(xì)胞團(tuán)沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495)，進(jìn)行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡），然后進(jìn)行點(diǎn)板。整個(gè)操作在金屬冰盒或冰上進(jìn)行。操作熟練以后，加膠，混勻，點(diǎn)板控制在半分鐘內(nèi)，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性。

（5）加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μL類器官培養(yǎng)基A進(jìn)行培養(yǎng)。大概7-10天，多數(shù)類器官直徑在200-300um，可進(jìn)行再次傳代。

凍存

凍存要領(lǐng):

類器官不需要消化（消化后的類器官復(fù)蘇活率低）；

在類器官指數(shù)增長(zhǎng)期凍存（等到該傳代的時(shí)候類器官活性比指數(shù)期差），也就傳代后的Day3-Day4，多數(shù)類器官直徑在100um-200um，這個(gè)時(shí)機(jī)選擇凍存。

一、類器官收集及洗滌

1、收集：移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G，輕柔吹散基質(zhì)膠，收集在15mL離心管中（24孔板，每5孔為一組）。

2、洗滌：加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多，基質(zhì)膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化，如果冰箱保溫效果強(qiáng)，縮短冷凍時(shí)間，摸索合適的冷凍時(shí)間時(shí)，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說明冷化好了）。

3、接下來將離心管進(jìn)行300g，4℃，離心5min，離心完通常會(huì)有這兩種情況：

第一種是正常情況，分成三層（如下圖），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。

第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關(guān)。此時(shí)棄掉緩沖液，留下基質(zhì)膠類器官混懸液，重復(fù)上一步洗滌步驟，再次冷化離心，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層、基質(zhì)膠層、類器官沉淀層），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠類器官混懸液層），此時(shí)棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠類器官混懸液，保留下2/3即可。

促進(jìn)基質(zhì)膠和類器官有效分離條件：

a 離心機(jī)的選擇非常重要，水平角離心機(jī)相比固定角離心機(jī)更利于基質(zhì)膠和類器官分離；

b 離心機(jī)的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化），離心轉(zhuǎn)速可適當(dāng)提高（最高不要超過500g），離心時(shí)間可適當(dāng)加長(zhǎng)（最常不超過10min）。

二、類器官凍存

1、凍存密度，以24孔板為例

密度建議1：2孔/mL凍存液

密度建議2：500個(gè)類器官/mL凍存液（如果想計(jì)數(shù)凍存，可以參照此密度建議）

2、添加適量類器官凍存液F，輕柔吹打重懸，建議立即進(jìn)行凍存。（放置太久，DMSO對(duì)類器官有損傷）

3、梯度凍存：將凍存管放入梯度凍存盒然后保存至-80℃過夜，第二天取出放入液氮罐。

     手動(dòng)凍存：4℃冰箱放置30min，轉(zhuǎn)移至-20℃放置1h，然后移至-80℃過夜，第二天取出放入液氮罐。

復(fù)蘇

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1、將水浴鍋預(yù)熱至37℃；

2、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒，用預(yù)防噴霧噴涂并且使用紫外線照射40min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面；

3、在超凈工作臺(tái)中按次序擺好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)板等。

二、取出凍存管

1、根據(jù)類器官凍存記錄按標(biāo)簽找到所需類器官的編號(hào)；

2、從液氮罐中取出凍存盒，取出所需的凍存管，同時(shí)核對(duì)凍存管外的編號(hào)。

三、迅速解凍

1、迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中解凍，并要不斷地?fù)u動(dòng)，使管中地液體迅速融化；

2、約1-2min后凍存管內(nèi)液體wan全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管地外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)。

四、將類器官凍存液移入15mL離心管，添加10倍體積類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G（緩沖液體積：凍存液體積=10:1）重懸，輕柔吹打混勻，300g 4℃離心5min，棄上清。

五、加膠-點(diǎn)板-加液

1、準(zhǔn)備工作

（1）基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

（2）槍頭、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí)；

（3）融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存，建議2周內(nèi)用完。

2、復(fù)蘇要求

24孔板(abs7035)，每孔25uL基質(zhì)膠類器官混合物，500-750uL類器官培養(yǎng)液。

3、復(fù)蘇密度

復(fù)蘇密度建議1：1:1接種（原來凍幾孔就復(fù)蘇幾孔）；

復(fù)蘇密度建議2：250個(gè)類器官/25uL基質(zhì)膠（如果想計(jì)數(shù)接種，可以參照此密度建議）。

4、加膠-點(diǎn)板

向類器官沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495)，進(jìn)行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡），然后進(jìn)行點(diǎn)板。整個(gè)操作在金屬冰盒或冰上進(jìn)行。操作熟練以后，加膠，混勻，點(diǎn)板控制在半分鐘內(nèi)，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性。

5、加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μL類器官培養(yǎng)基A進(jìn)行培養(yǎng)。大概10-14天，多數(shù)類器官直徑在200um-500um，可進(jìn)行傳代操作。

6、腦類器官鑒定圖

今天講解就到這了，大家如有實(shí)驗(yàn)問題，歡迎一起交流哦！

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