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CRISPR/Cas系統(tǒng)是細菌獲得性免疫的重要組成部分，由Cas核酸酶和兩種單獨的RNA成分組成，即可編程crRNA（CRISPR RNA）和固定的TracRNA（反式激活crRNA）。

2012年，Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier發(fā)現(xiàn)Cas9可以當作DNA切割工具，CRISPR/Cas9技術才真正開始受到廣泛關注。

CRISPR/Cas9調(diào)控機制

1、CRISPR的轉錄：CRISPR被轉錄成一條長RNA(pre-crRNA)，包含了重復序列和間隔序列。

2、tracrRNA的轉錄：tracrRNA轉錄成tracrRNA。

3、CRISPR/Cas9復合物的成熟：tracrRNA與pre-crRNA結合，經(jīng)過外源RNase III的剪切，Cas9也參與crRNA成熟。tracrRNA與crRNA融合即sgRNA，并與Cas9結合。

4、靶標識別：CRISPR/Cas9復合物掃描入侵的DNA，尋找與crRNA間隔序列互補的序列。識別過程中，crRNA的間隔序列與目標DNA（即gRNA）的特定序列（原間隔短回文重復序列鄰近基序，PAM）配對。

5、DNA切割：一旦找到匹配的序列，核酸酶Cas9就在PAM位點附近切割DNA雙鏈。核酸酶Cas9有兩個核酸酶結構域，HNH結構域切割DNA的一條鏈，RuvC結構域切割另一條鏈。

6、DNA修復：細菌或細胞通過非同源末端連接(NHEJ)或同源定向修復(HDR)機制修復DNA斷裂。NHEJ通常會導致插入或缺失(indels)，而HDR可以精確修復DNA，如果提供了修復模板的話。

注：CRISPR/Cas9系統(tǒng)的調(diào)控：在自然狀態(tài)下，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的激活是被動的，一旦crRNA與Cas9結合，系統(tǒng)就處于待激活狀態(tài)?？梢酝ㄟ^設計特定的gRNA來調(diào)控CRISPR/Cas9系統(tǒng)，使其靶向特定的基因序列。

圖1 CRISPR/Cas9調(diào)控[1]

圖2 CRISPR/Cas9剪切后的DNA修復[1]

CRISPR/Cas9的基因調(diào)控

CRISPR/Cas-9介導的基因組編輯已成為治療開發(fā)和生物醫(yī)學研究中一項潛在的創(chuàng)新技術。CRISPR/Cas9技術由于其靈活性、簡單性、高效性和精確基因組編輯的多重性而為疾病治療帶來了巨大的希望。

1、GM-CSF：CRISPR/Cas9介導的GM-CSF敲除，并與野生型CAR T細胞相比，GM-CSF^k/oCAR T細胞產(chǎn)生較少的GM-CSF而不減弱體內(nèi)抗腫瘤活性[2]。

圖3 A: 在野生型CART19和GM-CSF^k/o CART19上具有相似CAR表達的成功CAR-T細胞生產(chǎn)。
B: 通過細胞內(nèi)染色檢測，在用CD19陽性ALL細胞系NALM6刺激時，與野生型CART19相比，GM-CSF^k/o CART19細胞顯示出減少的GM-CSF

2、Frizzled 7：在腦內(nèi)出血(ICH)誘導前48h，通過腦室內(nèi)注射成簇規(guī)則間隔回文重復序列(CRISPR)進行Frizzled 7激活或敲低。結果表明激活Frizzled-7可顯著增加Dvl、β-Catenin、WISP1、VE-Cadherin、Claudin-5、ZO-1的表達，并降低磷酸-β-Catenin的表達。在ICH后24h，WISP1基因敲除可消除Frizzled 7激活對VE-Cadherin、Claudin-5和ZO-1表達的影響。因此，F(xiàn)rizzled 7可能是ICH患者BBB保護和改善預后的潛在治療靶點[3]。

相關產(chǎn)品：

參考文獻：

[1] Jiang F, Doudna JA. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annu Rev Biophys. 2017 May 22;46:505-529. doi: 10.1146/annurev-biophys-062215-010822. Epub 2017 Mar 30. PMID: 28375731.

[2] Sterner RM, Cox MJ, Sakemura R, Kenderian SS. Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells. J Vis Exp. 2019 Jul 22;(149). doi: 10.3791/59629. PMID: 31380838.

[3] He W, Lu Q, Sherchan P, Huang L, Hu X, Zhang JH, Dai H, Tang J. Activation of Frizzled-7 attenuates blood-brain barrier disruption through Dvl/β-catenin/WISP1 signaling pathway after intracerebral hemorrhage in mice. Fluids Barriers CNS. 2021 Sep 26;18(1):44. doi: 10.1186/s12987-021-00278-9. PMID: 34565396.

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