真核表達載體構(gòu)建實驗服務(wù)/實驗流程

一.服務(wù)介紹

分子克隆是在分子水平上提供一種純化和擴 增特定DNA*&片段的方法。常含有目的基因,用體外重組方法將它們插入克隆載體，形成重組克隆載體,通過轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導的方式，引入適合的寄主體內(nèi)得到復制與擴增，然后再從篩選的寄主細胞內(nèi)分離提純所需的克隆載體，可以得到插入DNA的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴增。

二、實驗原理

外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。DNA連接酶有兩種: T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在-起的功能， 而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應(yīng)分為3步:首先，T4DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶- AMP復合物;然后,酶一AMP復臺物再結(jié)合到具有5磷酸基和3羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化;后產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵， 把切口封起來。

DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法，為了防止載體本身的自連，可以通過(牛小腸堿性磷酸酶)CIP處理克服。

連接反應(yīng)的溫度在37°C時有利于連接酶的活性但是在這個溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此人們找到了一個折中溫度，即12-16°C， 連接12-16h(過夜), 這樣既可大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

三、實驗流程

1.目的DNA的擴增和純化;

2.連接反應(yīng);

3.電泳檢測連接產(chǎn)物。

四、客戶提供

樣本DNA，基因序列,試劑盒。

五、公司提供

構(gòu)建好的載體，電泳膠圖，測序結(jié)果。

實驗代做服務(wù)：