人外周血淋巴細(xì)胞分離液推動(dòng)了實(shí)驗(yàn)發(fā)展

    人外周血淋巴細(xì)胞分離液包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞等細(xì)胞，其體積、形態(tài)和密度與其他細(xì)胞不同，紅細(xì)胞和白細(xì)胞等細(xì)胞密度較大，為1.090 g/ml左右，而淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞密度為1.075～1.090 g/ml，血小板為1.030～1.035 g/ml。為此，將葡聚糖(右旋糖酐)和泛影酸葡甲胺按一定比例混合，調(diào)整比重、pH值和滲透壓，經(jīng)過(guò)澄清及除菌過(guò)濾后制成一種密度在1.077g/ml并且近于等滲的人外周血淋巴細(xì)胞分離液，經(jīng)過(guò)密度梯度離心使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。

    人外周血淋巴細(xì)胞分離液為帶有乳光或微乳光的滅菌水溶液。主要成分是Ficoll 400與泛影酸葡甲胺。人外周血淋巴細(xì)胞分離液適用于從血液分離所需細(xì)胞，在醫(yī)療和醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究中廣泛應(yīng)用。其他人及動(dòng)物多種比重細(xì)胞分離液。注：因不同種屬不同比重分離液的細(xì)胞離散系數(shù)及細(xì)胞帶電不同，所以用戶(hù)在定制分離液時(shí)應(yīng)提供所需分離液的比重、動(dòng)物的種屬及被分離細(xì)胞的名稱(chēng)。將采到的肝素抗凝血取樣計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù)。使用人外周血淋巴細(xì)胞分離液將血樣1：1稀釋?zhuān)靹驎r(shí)要沿管壁吹出，避免產(chǎn)生氣泡。吹勻后于37℃水浴中平衡。從冰箱中取出4℃避光保存的人外周血淋巴細(xì)胞分離液。搖勻后在無(wú)菌狀態(tài)下加入刻度離心管中。操作中盡量避免吸管碰觸管壁。原則上分離液的高度不超過(guò)管高的1/4。

    將盛有分離液的離心管放入37℃水浴中平衡，用吸管將稀釋的血液沿離心管壁徐徐加到分離液面上，用力要輕，避免血液沖入分離液中，使得稀釋血重疊在分離液面以上，擰緊管蓋。稀釋血與分離液的高度比在1：2-2：1之間。原則上兩者的總高度不超過(guò)離心管的2/3。將離心管放置于水平離心機(jī)中，室溫下 2000rpm離心20min。離心過(guò)程中要觀察離心速度是否正確，且在停止時(shí)選擇“no break”，避免因?yàn)榧眲p速將已經(jīng)分離的單個(gè)核細(xì)胞層重新弄混。注意離心結(jié)束時(shí)的減速過(guò)程，不要太快。人外周血淋巴細(xì)胞分離液離心結(jié)束后可見(jiàn)管內(nèi)分為四層，從上至下分別為：血漿層（含部分血小板）、白膜層（含單個(gè)核細(xì)胞及少量血小板）、分離液層、粒細(xì)胞及紅細(xì)胞層。將吸管輕輕穿過(guò)血漿層至白膜層，沿離心管周緣吸出血漿層與分離液層界面間的白膜層細(xì)胞，置于新離心管中。盡量少吸取分離液。

    人外周血淋巴細(xì)胞分離液注意吹打均勻，不要有細(xì)胞團(tuán)塊。室溫下1500rpm離心5min，洗滌兩次。zui后一次洗滌時(shí)定量加入RPMI1640，吹打均勻后取樣計(jì)數(shù)細(xì)胞，zui后一次離心完畢傾倒出上清液后請(qǐng)請(qǐng)要度離心管，將管底細(xì)胞搖勻。根據(jù)上一步的計(jì)數(shù)結(jié)果，用含F(xiàn)BS10%-20%、雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞配成所需濃度。人外周血淋巴細(xì)胞分離液的離心管以小管徑為佳，細(xì)胞層相對(duì)厚，便于淋巴細(xì)胞的吸取，2000rpm的相對(duì)離心力大概在573g-708g，不同的離心機(jī)可以注意計(jì)算一下離心力與轉(zhuǎn)數(shù)的關(guān)系。人外周血淋巴細(xì)胞分離液離心速度太慢或時(shí)間不足時(shí)，淋巴細(xì)胞層較薄，且在這個(gè)層面上有紅細(xì)胞混雜；離心速度太快或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，淋巴細(xì)胞層相對(duì)分散，會(huì)進(jìn)入下面的分離液層，每次將離心管帶入超凈臺(tái)內(nèi)時(shí)要用酒精擦拭離心管，尤其管口和管帽。