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美國Bio-Rad伯樂變性梯度凝膠電泳DGGE

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運用DGGE搜尋未知突變

DGGE 是基于以下原理,即增加聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)變性劑的濃度會熔解雙鏈DNA 的不同區(qū)域。當(dāng)溫度達(dá)到zui低熔解度區(qū)域的熔解溫度Tm 時,DNA 部分熔解,在凝膠中形成遷移率下降的分支分子(Myers et al.1987)。在均一的運行溫度(50—65°C)和尿素與甲酰胺線性變性梯度條件下即形成了變性環(huán)境。梯度以垂直或平行于電泳方向形成。DGGE 是zui靈敏的突變檢測方法,其效率可達(dá)99%Grompe 1993)。DCode 系統(tǒng)通過以下途徑優(yōu)化DGGE

  • 溫度控制模塊提供45–70°C 內(nèi)的*運行溫度
  • 系統(tǒng)可運行2 16 x 16 cm 凝膠或4 7.5 x 10 cm 凝膠
  • 可選擇的MacMelt WinMelt 軟件優(yōu)化了GC 夾及引物的置放

DGGE 的兩種模式。A ,凝膠的變性梯度方向與電泳方向垂直。從原生乳腺癌種擴(kuò)增的p53 基因6 號外顯子的野生型和突變型等位基因通過垂直DGGE80V,56°C2 小時)分離。感謝AL Borresen, Radium Hospital, Oslo, Norway 提供的數(shù)據(jù)。B ,凝膠的變性梯度方向與電泳方向平行。p53 基因8 號外顯子的野生型和突變型等位基因在8%丙烯酰胺:甲叉37.51 平行梯度(40–65% 變性劑)凝膠上,1 x TAE 緩沖液, 60°C,150 V,電泳2.5 個小時。左泳道,突變型等位基因;中,野生型等位基因;右,突變型與野生型等位基因。

DGGE分離示意圖。所示為一個變性梯度方向與電泳方向垂直的凝膠,以及一個有單個熔解區(qū)域的目標(biāo)序列。野生型和突變型樣品加入到制備孔內(nèi)。在低變性劑濃度時,DNA 片段為雙鏈,但當(dāng)濃度增加時雙鏈DNA 開始熔解,形成分枝分子。到濃度非常高時,DNA 片段可熔解形成2條單鏈。

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DGGE分離示意圖。所示為一個變性梯度方向與電泳方向垂直的凝膠,以及一個有單個熔解區(qū)域的目標(biāo)序列。野生型和突變型樣品加入到制備孔內(nèi)。在低變性劑濃度時,DNA 片段為雙鏈,但當(dāng)濃度增加時雙鏈DNA 開始熔解,形成分枝分子。到濃度非常高時,DNA 片段可熔解形成2條單鏈。



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