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轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒大量提試劑盒（溶液型）

轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒大提試劑盒（溶液型）核酸提取

目錄號(hào)：31114-20

產(chǎn)品內(nèi)容：

保存條件：

在室溫 (15 ~ 25℃) 條件下，可保存 12 個(gè)月。

RNase  A、內(nèi)毒素清除劑，可常溫運(yùn)輸，-20℃保存。

適用范圍：

特別適合用于大量轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒的制備，以及 BAC/PAC 等大型質(zhì)粒的制備。

產(chǎn)品簡介：

采用du特的溶液配方和內(nèi)毒素清除試劑，只需要幾次簡單的離心，就可以去除蛋白質(zhì)、多糖、內(nèi)毒素、RNA 等雜質(zhì)，獲得高質(zhì)量的轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒 DNA，可直接應(yīng)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染甚至動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等對(duì) DNA 純度要求很高的工作中。

本方法提取純化質(zhì)粒 DNA，對(duì)質(zhì)粒損傷小，即使是 10kb 甚至 100kb 以上的大型質(zhì)粒或超大型 BAC/PAC 質(zhì)粒，都可以有效純化。獲得的質(zhì)粒產(chǎn)量高，濃度可高達(dá) 5ug /ul，超螺旋比例可高達(dá) 95%，無內(nèi)毒素，轉(zhuǎn)染效果ji佳。

重要提示：

一、環(huán)境溫度低時(shí)溶液 P2 中 SDS 可能會(huì)析出出現(xiàn)渾濁或者沉淀，可在 37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清，不要?jiǎng)×覔u晃，以免形成過量的泡沫。

二、提取大質(zhì)粒時(shí), 操作動(dòng)作要輕柔，剪掉一部分吸頭的尖嘴，以增大開口，防止機(jī)械剪切對(duì) DNA 的損壞。

三、提取的質(zhì)粒量與細(xì)菌培養(yǎng)濃度、質(zhì)粒拷貝數(shù)等因素有關(guān)。如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?/span> 10kb 的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，同時(shí)按比例增加 P1、P2、P3 的用量。

四、得到的質(zhì)粒 DNA 電泳時(shí)可能為單一條帶，也可能為 2 條或者多條 DNA 條帶，這主要是不同程度的超螺旋構(gòu)象質(zhì)粒泳動(dòng)位置不一造成，與提取物培養(yǎng)時(shí)間長短、提取時(shí)操作劇烈程度等有關(guān)。本公司產(chǎn)品正常操作情況下基本超螺旋可以超過 95%。

五、shou次使用時(shí)請(qǐng)先將 RNase A 全部加到溶液 P1 中，混勻，每次使用后置于 2 ~ 8℃保存。

操作步驟：

1. 取 150 ml（最多 200ml）過夜培養(yǎng)的菌液，12,000 x g 于 4℃離心 2 min，盡量倒干上清，收集菌體。

（注意： 如果用 50 ml 離心管收集菌體，離心棄上清后，在同一管內(nèi)加入更多的菌液，重復(fù)步驟 1，直到收集到足夠多的菌體）

2. 加入 5 ml 溶液P1，重懸菌體沉淀，渦旋震蕩至che底懸浮, 室溫放置 3 ~ 5 分鐘。

（注意：如有未che底懸浮的菌塊會(huì)影響裂解，導(dǎo)致提取的質(zhì)粒濃度及純度降低）

3. 加入 5 ml 溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次，使菌體充分裂解，室溫放置 4 min。

（注意：不可劇烈震蕩，以免造成基因組 DNA 片段的污染，所用時(shí)間不要超過 5 min，以免質(zhì)粒受到破壞，如未wan全變得清亮，可能是菌體太多，可增加溶液 P2 的用量，在后續(xù)的操作中溶液 P3 的用量也要相應(yīng)增加）

4. 加入 5 ml 溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次，充分混勻，至白色絮狀物產(chǎn)生，然后

12,000 x g 于 4℃離心 10 ~ 15 min, 小心取上清，移入新的 50 ml 離心管中。

（注意：加入溶液 P3 后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生 SDS 的局部沉淀）

5. 加入 10 ml 異丙醇，上下顛倒離心管，充分混勻。

6. 在 4℃條件下 12,000~16,000 x g 離心 10 min，小心棄去上清，倒置輕輕瀝干殘余液體，加入 3-5ml 70%乙醇漂洗一遍，最高速離心 5 分鐘，棄上清，晾干沉淀。

（注意：DNA 沉淀如果干燥過頭，DNA 將無法wan全溶解，但是如果乙醇沒有晾干揮發(fā)干凈，殘留太多，也會(huì)造成 DNA 無法wan全溶解。）

7. 加入 1.4 ml 溶液P1 wan全溶解沉淀團(tuán)塊，注意附著在側(cè)壁上的質(zhì)粒沉淀雖然看不見，也

要吹打側(cè)壁涮洗下來（大質(zhì)?？捎脤捒谖茌p輕吹打輔助溶解）。然后將質(zhì)粒溶液轉(zhuǎn)入

2 個(gè)新的 1.5 ml 離心管中（每個(gè) 700 ul）。

8. 可選步驟（一般不需要）：如果菌株 RNA 豐富有微量 RNA 殘留，可在此步驟后將質(zhì)粒溶液 60℃孵育 15 min 消化 RNA。

9. 每管加入 55 ul 雜質(zhì)清除液 A，顛倒充分混勻后, 加入約 0.1 體積 (約 80ul ) 冰預(yù)冷的內(nèi)毒素清除劑，顛倒旋轉(zhuǎn) 7-10 次（30 秒左右）充分混勻，上清會(huì)變得渾濁，冰浴或者冰上放置>=5 min，中間偶爾顛倒混勻幾次，上清恢復(fù)清亮。

(注意：如果不需要去內(nèi)毒素用于轉(zhuǎn)染，可在此步驟只加入 55 ul 雜質(zhì)清除液A，充分混勻后冰上放置 5 分鐘，離心后小心取上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新管，直接接步驟 12。)

10. 42℃水浴，溶液又會(huì)變?yōu)闇啙?，顛倒混勻?42℃溫育 5 分鐘。

11. 室溫 14,000 x g 離心 5 min 分相，上層水相含 DNA，下層藍(lán)色油狀相含內(nèi)毒素和其它雜質(zhì)。將含DNA 的上層水相轉(zhuǎn)移到新管（注意不要吸到藍(lán)色油狀層，里面含內(nèi)毒素等雜質(zhì)），棄油狀層。

溶液必須分為上下兩相，否則應(yīng)重復(fù)步驟 10-11。

（溫度低時(shí)，內(nèi)毒素清除劑無法分相，因此必須 20℃以上室溫離心或者保證冬季轉(zhuǎn)頭溫度 20℃以上）

12. 將上一步所得上層水相中加入等體積雜質(zhì)清除液B（約 750 ul），輕柔混勻，14,000 x g于 4℃離心 10 min，棄上清（注意不要丟失 DNA），輕輕加入 1 ml 70%乙醇洗滌，離心棄上清，再用 1 ml 70%乙醇洗滌一次，室溫倒置晾干 5~10 min 使乙醇wan全揮發(fā)。

13. 每個(gè)離心管加 100~200 ul 純水或者 TE 溶解沉淀（可在 37℃水浴中振蕩以輔助溶解）。要注意很多質(zhì)粒 DNA 可能附著在離心管側(cè)壁上，即使看不見，也應(yīng)該充分吹打側(cè)壁溶解回收質(zhì)粒 DNA。（質(zhì)粒 DNA 可以根據(jù)需要，選擇任意小體積的純水溶解，濃度可達(dá) 5-10ug/ul）

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