諾博萊德 His-Tag蛋白純化磁珠（鈷離子） IDA-Cobalt

His-Tag蛋白純化磁珠（鈷離子）輔助試劑

產(chǎn)品貨號(hào)：M0198

產(chǎn)品名稱：His-Tag蛋白純化磁珠（鈷離子） IDA-Cobalt

產(chǎn)品規(guī)格：5mL/2×50mL

產(chǎn)品簡介：

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

NobleRyderM0198 His-Tag蛋白純化磁珠（鈷離子） IDA-Cobalt具有超順磁性，專為高效、快速純化組an酸標(biāo)簽蛋白而設(shè)計(jì)的一種新型功能化材料?？赏ㄟ^磁性分離方式直接從生物樣品中一步純化出高純度的目標(biāo)蛋白，極大地簡化純化工藝和提高純化效率，適合科研和工業(yè)領(lǐng)域便捷地進(jìn)行組an酸標(biāo)簽蛋白純化。

與傳統(tǒng)層析方式使用的金屬螯合瓊脂糖預(yù)裝柱相比，采用磁珠純化組an酸標(biāo)簽蛋白，無需對(duì)樣品進(jìn)行多次長時(shí)間的高速離心和濾膜過濾、無需控制流速、更無需高昂的層析設(shè)備。樣品與磁珠的特異性結(jié)合、洗滌以及目標(biāo)蛋白的洗脫變得簡單、快速、易操作。對(duì)于熟練的操作者而言，在 1h 內(nèi)就能獲得高純度的目標(biāo)蛋白，且能輕松實(shí)現(xiàn)高通量和大規(guī)模樣品的平行處理，為研究者節(jié)省了時(shí)間和成本。

本產(chǎn)品系列包括鎳離子（Nickel）、鈷離子（Cobalt）兩種金屬離子螯合磁珠，它們在目標(biāo)蛋白結(jié)合量和非特異性吸附等性能上有所區(qū)別，用戶可根據(jù)目標(biāo)蛋白與不同種類金屬的結(jié)合性能，以及對(duì)目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量和純度的要求，選擇不同種類的金屬離子螯合磁珠。

適用范圍：

適用于純化細(xì)菌、酵母、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等分泌或胞內(nèi)表達(dá)的可溶性組an酸標(biāo)簽蛋白，也可用于變性蛋白的純化（包涵體需變性后再進(jìn)行純化）。

操作步驟：（僅供參考）

1、緩沖液的準(zhǔn)備

目標(biāo)蛋白與組an酸標(biāo)簽蛋白純化磁珠的結(jié)合性能將直接影響目標(biāo)蛋白的純化效率，而各種緩沖液配制也將在一定程度上影響目標(biāo)蛋白的回收率和純度。因此，在較大規(guī)模蛋白純化之前，用戶應(yīng)該自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，篩選出適合純化目標(biāo)蛋白的緩沖液體系，主要包括 BindingBuffer、WashingBuffer、Elution Buffer。

增加咪唑濃度進(jìn)行洗脫是組an酸標(biāo)簽純化磁珠*chang用的洗脫方法，shou次使用時(shí)，在不確定最佳的洗脫咪 唑濃度情況下，推薦在緩沖液中分別加入 10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、300 mM、400mM、500mM mi唑，濃度從低到高分別洗脫，磁吸后收集蛋白上清液，之后通過 SDS-PAGE電泳等方法鑒定洗脫結(jié)果。

以下提供的緩沖液體系適用于多數(shù)組an酸標(biāo)簽蛋白的純化，供用戶參考。

Binding Buffer： 20 mMPhosphateBuffer，500mMNaCl，5~50mMImidazole，pH7.4

 Washing Buffer： 20mMPhosphateBuffer，500mMNaCl，50~100mMImidazole，pH7.4

 Elution Buffer： 20 mMPhosphateBuffer，500 mMNaCl，500mMImidazole，pH7.4

 2、樣本處理

（1）大腸桿菌、酵母等細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白：表達(dá)細(xì)胞用適量的 BindingBuffer 稀釋，加入蛋白酶抑制劑（如終濃度為 1mM 的 PMSF），重懸細(xì)胞，冰浴超聲裂解細(xì)胞，即為粗蛋白樣品。如果樣品過于粘稠，可根據(jù)需要在粗樣品中加入適量核酸酶，冰浴 30min，以降解核酸。另外，用戶也可以根據(jù)實(shí)際需要對(duì)蛋白樣品進(jìn)行離心操作。

（2）胞外表達(dá)蛋白：取胞外表達(dá)上清，用等量 BindingBuffer 稀釋，即為粗蛋白樣品。

（3）動(dòng)物細(xì)胞胞內(nèi)表達(dá)蛋白：取適量動(dòng)物細(xì)胞，先用適量 PBS 洗滌 1 次，棄上清；接著用適量含 1%（v/v） TritonX-100 或 1%（v/v） NP-40 的BindingBuffer 重懸，加入蛋白酶抑制劑（如終濃度為 1mM 的 PMSF），冰浴10min，即為粗蛋白樣品。

3、磁珠預(yù)處理

一般情況下，磁珠的使用量是由用戶根據(jù)目標(biāo)蛋白產(chǎn)量和磁珠載量信息計(jì)算獲得。例如：采用大腸桿菌表達(dá)某目標(biāo)蛋白，500mL 發(fā)酵液收獲 2g 濕重的菌體，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)估算其目標(biāo)蛋白產(chǎn)量為 10～20 mg，用戶需要取 5mL 磁珠懸液用于目標(biāo)蛋白的純化。以下即以此為例進(jìn)行詳細(xì)說明：

（1）將磁珠產(chǎn)品置于漩渦混勻器上充分混勻，用移液器取 5mL 磁珠懸液于 15mL 離心管中，進(jìn)行磁性分離*， 棄上清液，從磁性分離器上取下離心管。

（2）加入 5mLBindingBuffer 到上述裝有磁珠的離心管中，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸??；進(jìn)行磁性分離，移去上清液。重復(fù)洗滌 2 次。

（*：在磁性分離過程中，為了減少磁珠在使用過程中的損耗，待溶液變澄清后，蓋緊離心管蓋子，保持離心管 仍在磁性分離器上，手持磁性分離器與離心管上下翻轉(zhuǎn)數(shù)次，使澄清的溶液涮洗離心管蓋上殘留的磁珠，靜置片刻， 使溶液重新變澄清；以下同。）

4、目標(biāo)蛋白與磁珠結(jié)合

（1）用 10mLBindingBuffer 懸浮 2g 濕重的菌體，進(jìn)行破碎和裂解之后，即為目標(biāo)粗蛋白樣品，加入到裝有預(yù)處理磁珠的離心管中，將離心管置于漩渦混勻器振蕩 15s。

（2）將離心管置于旋轉(zhuǎn)混合儀上，室溫旋轉(zhuǎn)混合 20~30min（如果需要，可以在 2~8℃ 的低溫環(huán)境下，旋轉(zhuǎn)混 1h， 防止目標(biāo)蛋白降解）。

（3）將離心管置于磁性分離器上進(jìn)行磁性分離，移出上清液至新的離心管中以備后續(xù)檢測，從磁性分離器上取下離心管進(jìn)行后續(xù)洗滌步驟。

5、磁珠洗滌

（1）加入 10mLWashingBuffer 到裝有磁珠的離心管中，輕輕翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，移出清洗液到新的離心管中，以備取樣檢測。重復(fù)此步驟 1 次。

（2）加入 10mLWashingBuffer 到裝有磁珠的離心管，使磁珠重新懸浮，將磁珠懸液轉(zhuǎn)移到新的離心管（避免原離心管壁上非特異性吸附蛋白污染目標(biāo)蛋白），磁性分離，移出上清液到清洗液收集管。

6、目標(biāo)蛋白洗脫

（1）用戶可根據(jù)需要改變洗脫體積調(diào)整目標(biāo)蛋白濃度，加入 2~10mLElutionBuffer，輕輕翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠懸浮，磁性分離，收集洗脫液到新的離心管中，即為純化的目標(biāo)蛋白樣品。

（2）如果需要，可以重復(fù)上述步驟 1 次，收集樣品到新的離心管中，以檢測目標(biāo)蛋白是否洗脫wan全。

7、磁珠后處理

（1）在裝有磁珠的離心管中加入 5mLElutionBuffer，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠懸浮，磁性分離， 去除上清液。

（2）重復(fù)上述步驟 2 次。

（3）在離心管中加入 5mLddH2O，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠懸浮，磁性分離，去除上清液。

（4）重復(fù)上述步驟 2 次。

（5）加入 StorageBuffer 到磁珠中使總體積為 5mL，保存于 2~30℃（長期保存，置于 2~8℃），可用于下一次同種蛋白的純化。

8、磁珠再生

磁珠連續(xù)使用三次以上，其結(jié)合目標(biāo)蛋白的能力可能會(huì)明顯降低，建議進(jìn)行磁珠再生處理。

Stripping Buffer：20 mM SodiumPhosphate，500mMNaCl，100mMEDTA， pH7.4

BeadsWashing Buffer（可選）：0.5MNaOH，2MNaCl

Recharge Buffer：100 mMNiSO4/ CoCl2 （該化學(xué)試劑具有一定的毒性，可能造成過敏反應(yīng)，使用時(shí)務(wù)必注意自身安全）

Storage Buffer：20%（v/v）乙醇

以 5mL10%（v/v）磁珠懸液為例，詳細(xì)說明磁珠再生操作：

（1）將磁珠懸液進(jìn)行磁性分離，去除上清液，從磁性分離器上取下離心管，在離心管中加入 5mLddH2O， 上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液。

（2）加入 5mLStrippingBuffer，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，室溫旋轉(zhuǎn)混合 5min，磁性分離，去除上清液。重復(fù)此步驟 1 次。

（3）加入 5mLddH2O，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液，重復(fù)

此步驟 2 次。

（4）堿處理：加入 5mLBeadsWashingBuffer，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，室溫旋轉(zhuǎn)混合 5min，磁性分離，去除上清液。加入 5mLddH2O，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液。重復(fù) ddH2O 洗滌步驟 3~5 次，至洗滌液呈中性為止。

（5）加入 5mLRechargeBuffer，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，室溫旋轉(zhuǎn)混合 20min，磁性分離，去除上清液。

（6）加入 5mLddH2O，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液。重復(fù)此步驟 4 次以上，保證鎳離子去除wan全。

（7）加入 StorageBuffer 到磁珠中使總體積為 5mL，保存于 2~30℃ （長期保存，置于 2~8℃）

蛋白純化流程的優(yōu)化

以上操作流程適用于大部分組an酸標(biāo)簽蛋白的純化，根據(jù)目標(biāo)蛋白與金屬離子螯合磁珠的結(jié)合性能不同， 用戶可以從以下幾個(gè)方面對(duì)純化流程進(jìn)行優(yōu)化，以提高目標(biāo)蛋白的回收率和純度。

提高目標(biāo)蛋白回收率的參考方法：

（1）降低樣品溶液和BindingBuffer 中的 Imidazole 濃度；

（2）樣品溶液和其它緩沖液中添加表面活性劑等物質(zhì)；

（3）添加合適的蛋白酶抑制劑，防止目標(biāo)蛋白降解；

（4）增加磁珠用量；

（5）延長蛋白與磁珠孵育的時(shí)間；

（6）延長洗脫目標(biāo)蛋白的時(shí)間或增加洗脫次數(shù)。

提高目標(biāo)蛋白純度的參考方法：

（1）提高樣品溶液和BindingBuffer 中 Imidazole、NaCl 的濃度；

（2）樣品和緩沖液中添加表面活性劑等物質(zhì)；

（3）添加合適的蛋白酶抑制劑，防止目標(biāo)蛋白降解；

（4）延長洗滌的時(shí)間，增加洗滌次數(shù)；

（5）采用梯度 Imidazole 濃度洗脫目標(biāo)蛋白。

注意事項(xiàng)

1、shou次使用本產(chǎn)品前，請(qǐng)務(wù)必詳細(xì)閱讀本用戶手冊；

2、磁珠使用和保存過程中應(yīng)避免冷凍、干燥和高速離心等操作；

3、在使用本產(chǎn)品前，請(qǐng)務(wù)必充分振蕩使磁珠保持均勻的懸浮狀態(tài)；

4、請(qǐng)選用質(zhì)量好的移液器吸頭和離心管，以免磁珠貼壁或混合過程發(fā)生滲漏引起磁珠的損耗；

5、磁珠與溶液混合過程中，如果溶液粘稠無法通過翻轉(zhuǎn)離心管重懸磁珠，可采用移液器反復(fù)吹吸或短時(shí)漩渦混合使磁珠充分重懸；

6、用戶可根據(jù)實(shí)際需要保留經(jīng)磁性分離移去的上清液，進(jìn)行取樣檢測，以便分析純化過程和優(yōu)化蛋白純化流程；

7、本產(chǎn)品可以重復(fù)使用，當(dāng)純化性能降低時(shí)，建議進(jìn)行再生處理；

8、使用過的磁珠重復(fù)使用時(shí)，建議純化同種蛋白，純化不同種類的蛋白時(shí)，建議使用新的磁珠；

9、本產(chǎn)品需與磁性分離器配套使用；

10、本產(chǎn)品僅供研究使用。

 His-Tag蛋白純化磁珠（鈷離子）輔助試劑

產(chǎn)品訂購信息

M0198 His-Tag蛋白純化磁珠（鈷離子） IDA-Cobalt  5mL/2×50mL