諾博萊德 NHS磁珠 Magrose-NHS Magrose-NHS magnetic beads

NHS磁珠   輔助試劑-常備現(xiàn)貨

產(chǎn)品貨號：M0239

產(chǎn)品名稱：NHS磁珠 Magrose-NHS Magrose-NHS magnetic beads

英文名稱：Magrose-NHS magnetic beads

產(chǎn)品規(guī)格：1ml/5ml

產(chǎn)品簡介：

說明：20%(v/v)

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

NobleRyderM0239 NHS磁珠 Magrose-NHS Magrose-NHS magnetic beads表面為NHS 基團(tuán)修飾，能夠與帶有伯胺基團(tuán)的蛋白和其他分子形成穩(wěn)定的肽鍵，用于親和純化抗體、抗原和其他生物分子。與傳統(tǒng)的羧基、氨基磁珠相比，表面含 NHS 基團(tuán)的磁珠無需事先采用EDC/NHS或戊二醛進(jìn)行活化，只需簡單地將含伯氨基的生物配體溶解在試劑盒自帶的Coupling Buffer 中，室溫下將蛋白與NHS 磁珠混合1~2h 便可將生物配體共價(jià)偶聯(lián)到磁珠上，

具有操作簡單、偶聯(lián)條件溫和、生物配體偶聯(lián)快速高效等優(yōu)點(diǎn)。磁珠偶聯(lián)過程必需在不含任何氨基的緩沖溶劑中進(jìn)行。人工操作時(shí)，使用磁性分離架實(shí)現(xiàn)磁珠與溶劑分離。也可采用自動化設(shè)備操作，自動化操作適合用于多樣品的篩選。

蛋白偶聯(lián)操作流程及優(yōu)化點(diǎn)

1.蛋白溶液的配制

2.磁珠的洗滌

3.蛋白偶聯(lián)：（優(yōu)化）

(1) Coupling Buffer 的種類。首先通過實(shí)驗(yàn)確定最合適的CouplingBuffer

 (2) 確定合適的CouplingBuffer 后，再通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化蛋白溶液的濃度

4.封閉

5.磁珠保存

6.注意事項(xiàng)：

(1) 其中磁珠洗滌要嚴(yán)格按照說明書采用冷卻的WashingBufferA快速洗滌，以防磁珠在洗滌過程中NHS基團(tuán)水解；

(2) 蛋白偶聯(lián)過程中， 首先要通過實(shí)驗(yàn)確定合適的CouplingBuffer（主要包括CouplingBufferA、Coupling Buffer B、50 mM 硼酸溶液，pH8.5、100mM 磷酸緩沖液，100mMNaCl，pH7.4 這四種）；

(3) 確定合適的 CouplingBuffer 后，再以此 CouplingBuffer 為基礎(chǔ)，確定合適的偶聯(lián)蛋白濃度，因?yàn)榈鞍诐舛仍礁撸悸?lián)到磁珠上的蛋白的量會越大（這是由于NHS基團(tuán)跟蛋白偶聯(lián)和NHS 基團(tuán)本身水解是一對競爭反應(yīng)）。當(dāng)然此處要綜合考慮使用性能和成本，有些客戶偶聯(lián)少量的蛋白便可滿足使用需求，這時(shí)采用低濃度的蛋白便可，這樣可以降低成本。

(4) 封閉這一步可以采用試劑盒中自帶的3M乙醇胺，也可使用Tris 緩沖液（100mMTris-HCl,150 mMNaCl, pH 8.0），封閉時(shí)間不得低于2h，如果化學(xué)封閉后背景仍然很高，還可以額外加一步 BSA 封閉。

蛋白偶聯(lián)操作步驟

以下操作過程以取磁珠樣品500μL，采用1.5mLEP 管為例介紹。用戶可根據(jù)自身需求按比例調(diào)整：

1. 蛋白溶液配制：

取適量待偶聯(lián)蛋白用 CouplingBuffer 溶解，配成濃度為≥3.0mg/mL 的蛋白溶液。已經(jīng)保存于buffer 中的蛋白，需要通過透析或者脫鹽的方法che底除去原有 buffer 里含伯胺基的物質(zhì)，然后再用Coupling Buffer 配成濃度為≥3.0 mg/mL 的蛋白溶液，將配制好的蛋白溶液于 4oC 保存?zhèn)溆谩?/span>

注：(1)為了達(dá)到更好的性能，蛋白濃度≥3.0mg/mL，這樣偶聯(lián)效率會更高，此處需綜合考慮成本和

使用要求；

(2)蛋白溶液中不能含有帶伯氨基的成分，比如 Tris，甘an酸，明膠，BSA 等；

2. 磁珠清洗

1) 取 500μL20%的磁珠懸浮液于 1.5mLEP 管中。

注：磁珠取樣前要反復(fù)顛倒、使用渦旋振蕩器使其混合均勻，以保證實(shí)驗(yàn)的同一性，每取一次樣需要重新混勻。

2) 將EP 管置于磁性分離架內(nèi)，富集磁珠，去除上清液。

3) 加 1mL2~8oC 的WashingBufferA于離心管中，渦旋 15s，使磁珠混合均勻。

4) 將EP 管置于磁性分離架內(nèi)，富集磁珠，去除上清液。

3. 蛋白質(zhì)固定

1) 加 200μL 蛋白溶液于EP 管中，渦旋 30s，使其混合均勻。

注：磁珠洗滌后要立即加入蛋白溶液。

2) 將EP 管渦旋 15s，置于垂直混合儀上，室溫混合 2~4h。如果垂直混合不均勻，則反應(yīng)前 30min，每隔 5min 取下EP 管渦旋 15s。此后，每隔 15min，取下EP 管渦旋 15s。

注：如有需要可以在 4oC 反應(yīng)過夜。

3) 采用磁性分離架富集磁珠，保存流穿液。

4. 磁珠封閉

1) 加 1mLBlocking Buffer 于 EP 管中，渦旋 30s，將EP 管置于磁性分離架內(nèi)，富集磁珠，棄上清液。

注：Blocking Buffer除了試劑盒中提供的 3M 乙醇胺外，也可以使用 100mMTris-HCl,150mM NaCl, pH 8.0 等其它封端試劑。

2) 重復(fù)“步驟4-1”四次。

3） 加 1mLBlockingBuffer于EP 管中，渦旋 30s，將EP 管置于垂直混合儀中室溫反應(yīng) 2h。

4） 將EP 管置于磁性分離架內(nèi)，富集磁珠，棄上清液。

5） 加 1mL 超純水于EP 管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，棄上清液。

5. 保存

1） 加 1mLStorageBuffer（比如含 0.05%疊氮化na的PBS 緩沖液，或者客戶根據(jù)自己實(shí)際需求選擇合適的保存溶液 ）于 EP 管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，棄上清液。重復(fù)該操作 2 次。

2） 加入 1mLStorageBuffer 于EP 管中，充分混合，4oC 保存?zhèn)溆谩?/span>

注：最終偶聯(lián)蛋白的磁珠濃度為 10%(v/v)。

注意事項(xiàng)

1. 磁珠對水分敏感。為了保證產(chǎn)品質(zhì)量，在取樣之后需立即蓋上瓶蓋，并用封口膜密封，于4℃保存。

2. 禁止將磁珠干燥或冷凍。干燥和冷凍操作可能導(dǎo)致磁珠的聚集從而喪失結(jié)合活性。

3. 可通過直接法（BCA ）檢測偶聯(lián)到磁珠表面的蛋白含量。使用280nm附近的波長來測定蛋白含量是不可取的，因?yàn)镹HS 基團(tuán)在280nm波長附近有很強(qiáng)的吸收，會嚴(yán)重干擾檢測結(jié)果。蛋白穩(wěn)定劑（如 BSA，gelatin）會抑制抗體與磁珠的結(jié)合，因此在磁珠偶聯(lián)抗體過程中，需要確?？贵w保存體系中不存在含伯氨基的蛋白穩(wěn)定劑。

4. 緩沖液中含有帶伯胺的物質(zhì)會抑制蛋白質(zhì)偶聯(lián)到磁珠表面，去除伯胺物質(zhì)可采用透析和脫鹽的方法。

5. NHS 基團(tuán)易水解，故在用 WashingBufferA 洗滌時(shí)，一定要參照說明書進(jìn)行。

6. 蛋白溶液要預(yù)先配制好，WashingBufferA 洗滌完畢后，要立即加入蛋白溶液進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。

7. 蛋白質(zhì)和磁珠的偶聯(lián)效率因蛋白質(zhì)種類和性質(zhì)差異而不同。一般而言，蛋白質(zhì)濃度為≥3.0mg/mL 時(shí)利于蛋白質(zhì)偶聯(lián)；然而，對于不同的蛋白其濃度需要優(yōu)化。

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