分析原理
在均相時間分辨熒光（HTRF）相互作用分析中，一部分（直接或間接）用供體進(jìn)行標(biāo)記，另一部分用受體進(jìn)行標(biāo)記（同樣直接或間接）。信號強(qiáng)度與兩部分的結(jié)合程度成正比。在此處所示的示例中：鏈霉親和素 - 鋱穴狀化合物與化的標(biāo)記部分 A 結(jié)合，而B部分 * 與用 HTRF 受體標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合。* B部分也可以是化、帶有標(biāo)簽、Fc 融合的。在這些情況下，使用相應(yīng)的用受體標(biāo)記的 HTRF 試劑（抗標(biāo)簽、抗物種、蛋白 A、鏈霉親和素）進(jìn)行檢測。

分析方案
如下示例描述了使用 20 µL 最終分析體積檢測化標(biāo)記的A部分和未標(biāo)記的 B部分* 之間相互作用的方案。分裝兩部分（10 µL），孵育，加入鏈霉親和素 - 鋱穴狀化合物（5 µL）和用受體標(biāo)記的抗 B部分（5 µL），孵育并讀取。* B部分也可以帶有標(biāo)簽、Fc 融合或直接標(biāo)記。在這些情況下，使用相應(yīng)的用供體標(biāo)記的 HTRF 試劑（抗標(biāo)簽、抗物種、蛋白 A、鏈霉親和素）進(jìn)行檢測。

分析細(xì)節(jié)
測試次數(shù)與活性部分有何關(guān)系？

每個孔的平均結(jié)合物數(shù)量反映了總體生物材料含量。通常優(yōu)選使用活性部分的量而不是總結(jié)合物的量。對于穴狀化合物和 d2 結(jié)合物，總結(jié)合物的量等于活性部分的量，因?yàn)闃?biāo)記的分子量可以忽略不計(jì)。對于用 XL665 標(biāo)記的實(shí)體則不是這樣，總結(jié)合物的量將根據(jù) XL665 結(jié)合物的最終摩爾比而變化，但是，由 Revvity 提供的活性部分的量是恒定的，并基于訂購的測試次數(shù)。

A

穴狀化合物和 XL665 結(jié)合物的推薦用量
穴狀化合物結(jié)合物不能過量，以防止讀數(shù)器飽和和不可接受的背景水平。在大多數(shù)情況下，1 至 5nM 的穴狀化合物濃度是合適的，并且根據(jù)所使用的與 HTRF 兼容的讀數(shù)器，在 620nm 處將產(chǎn)生 20,000 至 80,000 cps。XL665 結(jié)合物必須盡可能與其分析對應(yīng)物匹配，以便最大數(shù)量的生物分子被 XL665 受體標(biāo)記。因此，要在 20nM 的分析濃度下檢測標(biāo)記分子，抗標(biāo)簽 - XL665 的濃度應(yīng)是等摩爾或更高。