腸道類器官是研究腸癌、炎癥性腸?。↖BD）及腸道發(fā)育的“黃金模型”，其構(gòu)建核心在于精準(zhǔn)調(diào)控干細(xì)胞微環(huán)境。本文將手把手拆解腸道類器官構(gòu)建流程，并揭秘關(guān)鍵細(xì)胞因子的種類、濃度及功能，助你輕松掌握這一前沿技術(shù)！

腸道類器官：為何成為研究熱點(diǎn)？

腸道類器官能高度模擬腸上皮的隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)，保留腸道干細(xì)胞的自我更新與分化能力，廣泛應(yīng)用于：

?疾病建模：如克羅恩病、腸癌的分子機(jī)制研究

?藥物篩選：評(píng)估藥物吸收、代謝及毒性

?宿主-微生物互作：研究腸道菌群與上皮相互作用

腸道類器官的“四大要素”

1. 細(xì)胞來源

成人腸道隱窩干細(xì)胞：從手術(shù)或活檢樣本中分離（需倫理審批）

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）：通過定向分化生成腸上皮細(xì)胞

2. 核心培養(yǎng)基配方

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：Advanced DMEM/F12（含GlutaMAX、HEPES）

3. 基質(zhì)膠選擇

Matrigel：常用濃度50-70%，模擬基底膜微環(huán)境

替代方案：合成水凝膠（如PEG-based），避免批次差異

4. 培養(yǎng)條件

氣體環(huán)境：37℃、5% CO?，低氧條件（2-5% O?）可提高干細(xì)胞活性

培養(yǎng)基更換：每2-3天更換一次，維持細(xì)胞因子濃度穩(wěn)定

分步構(gòu)建流程（以成人腸道隱窩為例）

? 樣本處理：

取新鮮腸道組織，PBS清洗后剪碎。

使用含EDTA的冷緩沖液震蕩（30分鐘），釋放隱窩單元。

?隱窩分離：

通過70 μm濾網(wǎng)過濾，離心（300g，5分鐘）收集隱窩。

?基質(zhì)膠包埋：

將隱窩與Matrigel混合（密度：200-500隱窩/50 μL膠），點(diǎn)膠于預(yù)熱的培養(yǎng)板。

?培養(yǎng)基覆蓋：

添加含上述細(xì)胞因子的完quan培養(yǎng)基（每孔500 μL）。

?動(dòng)態(tài)觀察：

第3天：隱窩形成閉合球狀結(jié)構(gòu)。

第5-7天：出現(xiàn)典型“出芽”結(jié)構(gòu)（類隱窩和絨毛）。

常見問題與優(yōu)化技巧

?類器官不生長？

檢查Wnt3a活性：Wnt信號(hào)不足會(huì)導(dǎo)致干細(xì)胞分化。

優(yōu)化基質(zhì)膠比例：Matrigel濃度過高可能限制營養(yǎng)滲透。

?結(jié)構(gòu)異常？

調(diào)整Noggin濃度：BMP抑制不足易導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞過度生長。

縮短傳代周期：建議每7-10天機(jī)械破碎傳代一次。

?如何提高存活率？

添加Y-27632：尤其在初始培養(yǎng)階段減少凋亡。

避免頻繁震動(dòng)：培養(yǎng)箱內(nèi)保持穩(wěn)定，防止基質(zhì)膠破裂。

應(yīng)用場景舉例

?腸癌模型：

將CRISPR編輯的致癌基因（如APC突變）導(dǎo)入類器官，模擬腫瘤進(jìn)展。

?藥物毒性測試：

添加化療藥物（如5-FU），通過活細(xì)胞成像評(píng)估腸上皮損傷。

?腸道感染研究：

共培養(yǎng)沙門氏菌或諾如病毒，觀察上皮屏障破壞機(jī)制。