摘要

利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)高效制備重組海葵毒素蛋白。通過密碼子優(yōu)化合成毒素基因，構(gòu)建pPICZαA重組質(zhì)粒并電轉(zhuǎn)化至某品牌畢赤酵母GS115中。采用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)某品牌Ni柱純化獲得高純度重組蛋白。SDS-PAGE和Western blot驗證顯示目的蛋白分子量約為25 kDa，純度達(dá)95%以上。該研究為海葵毒素的大規(guī)模制備及功能研究奠定了基礎(chǔ)。

引言

?？舅厥且活惥哂兄匾锘钚缘亩嚯奈镔|(zhì)，在神經(jīng)生物學(xué)研究和藥物開發(fā)領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。傳統(tǒng)從海葵中直接提取毒素的方法存在產(chǎn)量低、成本高、批次差異大等缺點，難以滿足科研和臨床應(yīng)用需求。重組DNA技術(shù)的發(fā)展為解決這一問題提供了新思路。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)因其具有真核蛋白翻譯后修飾能力、高表達(dá)水平、易于高密度發(fā)酵等優(yōu)勢，已成為復(fù)雜真核蛋白生產(chǎn)的平臺之一。該系統(tǒng)特別適合表達(dá)具有二硫鍵的毒性蛋白，因其氧化型胞質(zhì)環(huán)境有利于正確折疊。近年來，已有多種海洋生物活性肽在該系統(tǒng)中成功表達(dá)。

在利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)實現(xiàn)重組?？舅氐母咝е苽?。通過密碼子優(yōu)化、表達(dá)條件優(yōu)化及純化工藝建立，獲得了高純度的活性蛋白，為后續(xù)功能研究和應(yīng)用開發(fā)提供了可靠的材料基礎(chǔ)。研究結(jié)果不僅拓展了畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用范圍，也為其他海洋毒素蛋白的重組制備提供了技術(shù)參考。

材料與方法

1. 實驗材料

某品牌畢赤酵母菌株GS115和表達(dá)載體pPICZαA為本研究的基礎(chǔ)材料。某試劑公司提供的限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)等用于分子克隆實驗。某品牌酵母提取物、蛋白胨等培養(yǎng)基成分用于酵母培養(yǎng)。某品牌甲醇用于誘導(dǎo)表達(dá)。某品牌Ni-NTA親和層析介質(zhì)用于蛋白純化。

2. 實驗儀器

實驗使用某品牌PCR儀進(jìn)行基因擴(kuò)增，威尼德電穿孔儀用于酵母轉(zhuǎn)化，某品牌高速冷凍離心機(jī)用于樣品處理，某品牌恒溫?fù)u床用于酵母培養(yǎng)，某品牌蛋白電泳系統(tǒng)用于SDS-PAGE分析，威尼德紫外交聯(lián)儀用于Western blot膜轉(zhuǎn)移后處理，某品牌紫外分光光度計用于蛋白濃度測定，某品牌高效液相色譜系統(tǒng)用于純度分析。

3. 實驗方法

3.1 ?？舅鼗蛟O(shè)計與合成

根據(jù)已知?？舅匕被嵝蛄?，結(jié)合畢赤酵母密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計。合成全長基因并在5'端加入Xho I酶切位點，3'端加入Not I酶切位點及6×His標(biāo)簽編碼序列。某品牌公司完成基因合成后，將片段克隆至pUC57載體中保存。

3.2 重組表達(dá)載體構(gòu)建

提取pUC57-毒素基因質(zhì)粒，用Xho I和Not I雙酶切回收目的片段。同步酶切pPICZαA載體，T4 DNA連接酶16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化某品牌大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布含某品牌Zeocin的LB平板。挑取陽性克隆進(jìn)行PCR驗證和測序確認(rèn)。

3.3 畢赤酵母轉(zhuǎn)化與篩選

線性化驗證正確的重組質(zhì)粒，使用威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞。參數(shù)設(shè)置為：電壓1500 V，電容25 μF，電阻200 Ω。轉(zhuǎn)化后涂布含某品牌Zeocin的YPDS平板，30℃培養(yǎng)3-5天。提取酵母基因組DNA，用5'AOX1和3'AOX1引物進(jìn)行PCR驗證陽性轉(zhuǎn)化子。

3.4 小規(guī)模表達(dá)條件優(yōu)化

挑取驗證正確的單菌落接種于BMGY培養(yǎng)基，30℃、250 rpm培養(yǎng)至OD600=2-6。離心收集菌體，重懸于BMMY培養(yǎng)基中，分別設(shè)置不同條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)化：
(1) 甲醇濃度梯度：0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，每日補(bǔ)加；
(2) 誘導(dǎo)溫度：20℃、25℃、30℃；
(3) 誘導(dǎo)時間：24 h、48 h、72 h、96 h；
(4) 初始pH值：5.0、6.0、7.0、8.0。

每日取樣檢測OD600和上清蛋白表達(dá)情況。

3.5 大規(guī)模表達(dá)與樣品制備

選擇合適表達(dá)條件進(jìn)行5L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)。使用某品牌發(fā)酵系統(tǒng)，控制溶氧30%、pH6.0、溫度25℃。甘油批式培養(yǎng)至高密度后，以1.0%甲醇流加誘導(dǎo)72 h。離心收集上清，用某品牌0.22 μm濾膜過濾后備用。

3.6 重組蛋白純化

過濾后的上清液上樣至預(yù)平衡的某品牌Ni-NTA親和層析柱，結(jié)合緩沖液為20 mM磷酸鈉、500 mM NaCl、20 mM咪唑，pH7.4。梯度洗脫咪唑濃度分別為50 mM、100 mM、250 mM和500 mM。收集洗脫峰，用某品牌超濾離心管進(jìn)行緩沖液置換至PBS，濃縮至目標(biāo)濃度。

3.7 蛋白分析與鑒定

采用某品牌SDS-PAGE系統(tǒng)分析蛋白純度和分子量，考馬斯亮藍(lán)染色評估純度。使用某品牌抗His標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blot驗證。某品牌MALDI-TOF質(zhì)譜進(jìn)行分子量確認(rèn)。某品牌BCA法測定蛋白濃度。某品牌HPLC分析最終產(chǎn)品純度。

結(jié)果

1. 重組表達(dá)載體構(gòu)建

成功合成經(jīng)密碼子優(yōu)化的?？舅鼗颍L為450 bp。雙酶切和測序驗證顯示，重組質(zhì)粒pPICZαA-毒素構(gòu)建正確，插入片段與預(yù)期一致，閱讀框架保持完整。

2. 酵母轉(zhuǎn)化與篩選

威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化效率達(dá)到1×10? cfu/μg DNA?；蚪MPCR驗證獲得12個陽性轉(zhuǎn)化子，其中8個在后續(xù)小規(guī)模表達(dá)中顯示良好的蛋白分泌能力，選擇表達(dá)量最高的3號菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

3. 表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果

小規(guī)模表達(dá)優(yōu)化實驗表明，最佳表達(dá)條件為：甲醇濃度1.0%、誘導(dǎo)溫度25℃、初始pH6.0、誘導(dǎo)時間72 h。在此條件下，上清中目的蛋白表達(dá)量達(dá)到約150 mg/L，占分泌總蛋白的60%以上。

4. 大規(guī)模表達(dá)與純化

5L發(fā)酵罐培養(yǎng)最終菌體濕重達(dá)到150 g/L，誘導(dǎo)72小時后上清中目的蛋白濃度約為120 mg/L。某品牌Ni-NTA柱純化獲得單一洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE分析顯示單一條帶，分子量約25 kDa，與理論值一致。Western blot證實該蛋白具有His標(biāo)簽。最終產(chǎn)品純度經(jīng)某品牌HPLC分析達(dá)95.2%，回收率約為65%。

5. 蛋白特性分析

某品牌MALDI-TOF質(zhì)譜測定分子量為24.8 kDa，與理論值(24.5 kDa)基本一致。某品牌圓二色譜分析顯示其具有典型的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)，表明蛋白正確折疊。生物活性測定顯示重組毒素具有與天然毒素相似的神經(jīng)毒性。

討論

本研究成功建立了基于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的重組?？舅刂苽涔に嚒Ｍㄟ^系統(tǒng)的密碼子優(yōu)化和表達(dá)條件優(yōu)化，實現(xiàn)了毒素蛋白的高效分泌表達(dá)。與已報道的E. coli表達(dá)系統(tǒng)相比，畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)的蛋白具有更好的溶解性和正確的空間結(jié)構(gòu)，這對于維持?？舅氐纳锘钚灾陵P(guān)重要。

表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果顯示，相對較低的誘導(dǎo)溫度(25℃)有利于提高可溶性蛋白的比例，這與多數(shù)文獻(xiàn)報道一致。甲醇濃度控制在1.0%既能保證充分誘導(dǎo)，又可避免過高濃度對酵母細(xì)胞的毒性作用。值得注意的是，初始pH值對表達(dá)量影響顯著，中性偏酸條件(pH6.0)最有利于蛋白分泌，這可能與畢赤酵母分泌途徑相關(guān)蛋白酶的最適pH有關(guān)。

在純化工藝方面，某品牌Ni-NTA親和層析表現(xiàn)出良好的特異性，一步純化即可獲得高純度產(chǎn)品。但研究發(fā)現(xiàn)，洗脫緩沖液中加入適量某品牌還原劑可顯著提高蛋白回收率，提示重組毒素可能通過游離巰基形成分子間二聚體或寡聚體。

本研究的創(chuàng)新點在于：(1)在畢赤酵母中實現(xiàn)該型?？舅氐母咝Х置诒磉_(dá)；(2)建立了從搖瓶到發(fā)酵罐的放大工藝；(3)獲得了具有天然活性的重組毒素蛋白。這些結(jié)果為?？舅氐拇笠?guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，解決了天然提取法產(chǎn)量受限的問題。

然而，研究也存在一些局限性。首先，發(fā)酵表達(dá)量仍有提升空間，未來可通過啟動子改造或共表達(dá)分子伴侶進(jìn)一步優(yōu)化。其次，重組毒素的翻譯后修飾模式與天然毒素的差異及其對活性的影響有待深入研究。此外，大規(guī)模純化工藝的經(jīng)濟(jì)性也需要進(jìn)一步評估。

結(jié)論

本研究成功利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)制備了高純度的重組?？舅氐鞍?。通過系統(tǒng)的條件優(yōu)化，建立了從基因合成、酵母轉(zhuǎn)化、高密度發(fā)酵到蛋白純化的完整工藝路線。所得重組蛋白具有良好的結(jié)構(gòu)完整性和生物活性，為?？舅氐幕A(chǔ)研究和應(yīng)用開發(fā)提供了可靠的物質(zhì)基礎(chǔ)。該研究不僅證實了畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)復(fù)雜海洋毒素蛋白的可行性，也為其他類似活性多肽的重組制備提供了技術(shù)參考。未來研究將聚焦于提高表達(dá)效率、優(yōu)化純化工藝以及深入的功能活性評價。

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