一、實(shí)驗(yàn)背景與目的  

腦類器官作為模擬人腦結(jié)構(gòu)和功能的體外三維模型，在神經(jīng)發(fā)育、疾病機(jī)制和藥物篩選研究中具有重要價(jià)值。然而，傳統(tǒng)靜態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)存在營養(yǎng)物質(zhì)梯度不均、氧合受限等問題，影響類器官的成熟度和功能性。北京基爾比生物科技公司開發(fā)的微重力三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)通過模擬微重力環(huán)境，可顯著改善細(xì)胞外基質(zhì)分布、促進(jìn)細(xì)胞間相互作用，并減少剪切力損傷，為腦類器官的高效培養(yǎng)提供了創(chuàng)新解決方案。  

本實(shí)驗(yàn)方案旨在利用北京基爾比生物公司研制的微重力三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng) 【如 Clinostat, Beijing Kilby】培養(yǎng)腦類器官，評估其在微重力環(huán)境下的生長特性、細(xì)胞組成及功能表現(xiàn)，并與傳統(tǒng)靜態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)對比，驗(yàn)證其技術(shù)優(yōu)勢。

二、實(shí)驗(yàn)材料  

1. 細(xì)胞來源：人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs，如IMR90-4株）。  

2. 培養(yǎng)試劑：  

  - 神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含LDN-193189、SB431542、XAV939等小分子抑制劑）。  

  - 神經(jīng)分化培養(yǎng)基（含B27、N2、BDNF、cAMP等）。  

3. 微重力培養(yǎng)系統(tǒng)：北京基爾比生物科技三維旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器（如 Clinostat, Beijing Kilby參數(shù)：轉(zhuǎn)速5 rpm，傾角10°，37℃恒溫，5% CO?）。  

4. 檢測工具：  

  - 活細(xì)胞成像系統(tǒng)（如Nikon Eclipse Ti2）。  

  - qPCR儀、Western blot設(shè)備、LC-MS/MS（用于神經(jīng)遞質(zhì)分析）。  

三、實(shí)驗(yàn)步驟  

1. 腦類器官的制備與微重力培養(yǎng)

- 階段1：神經(jīng)誘導(dǎo)（0-10天）

 - 將iPSCs以2×10? cells/well接種于U型低吸附96孔板，使用神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)，每2天換液。  

 - 微重力組：第5天轉(zhuǎn)移至微重力生物反應(yīng)器，持續(xù)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)（5 rpm）。  

- 階段2：神經(jīng)分化（10-120天）

 - 將類器官轉(zhuǎn)移至6孔板，使用神經(jīng)分化培養(yǎng)基（NDM-I），微重力組維持旋轉(zhuǎn)條件。  

 - 第18天后更換為含維生素A的NDM-II培養(yǎng)基，添加BDNF和cAMP，每4天換液。  

2. 微塑料（MP）暴露實(shí)驗(yàn)

- 參考Park et al. (2025)方法，將50 nm和100 nm熒光標(biāo)記MP（10 mg/mL）加入培養(yǎng)基，處理21天，評估MP滲透深度及毒性。  

3. 檢測與分析

3.1 形態(tài)學(xué)評估：  

 - 激光共聚焦顯微鏡觀察類器官結(jié)構(gòu)（如神經(jīng)元層、腦室樣區(qū)域）。  

 - 免疫熒光染色（標(biāo)記PAX6、SOX2、TUJ1、GFAP等）。  

3.2 功能分析：  

 - qPCR：檢測神經(jīng)發(fā)育基因（如FOXG1、OTX2）及凋亡相關(guān)基因（BAX、BCL-2）。  

 - Western blot：分析凋亡標(biāo)志物（cleaved caspase-3）及突觸蛋白（Synapsin-1）。  

 - 神經(jīng)遞質(zhì)檢測：LC-MS/MS定量谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）等。  

- 微重力效應(yīng)驗(yàn)證：  

 - 對比靜態(tài)培養(yǎng)組，評估類器官直徑、細(xì)胞存活率（CellTiter-Glo® 3D試劑）及氧消耗率（Seahorse分析儀）。  

四、預(yù)期結(jié)果  

1. 微重力組腦類器官呈現(xiàn)更均勻的細(xì)胞分布、更大的體積（>500 μm）及更成熟的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)。  

2. MP暴露實(shí)驗(yàn)中，50 nm MP在微重力條件下滲透更深（>300 μm），但凋亡率顯著低于靜態(tài)培養(yǎng)組（微重力可能緩解MP毒性）。  

3. 神經(jīng)遞質(zhì)分泌譜顯示微重力組Glu/GABA比例更接近體內(nèi)水平。  

五、應(yīng)用前景  

北京基爾比生物公司研制的微重力三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng) 【如 Clinostat, Beijing Kilby】可優(yōu)化腦類器官的仿生性，適用于：  

- 神經(jīng)毒性研究：如環(huán)境污染物（MP、重金屬）的作用機(jī)制。  

- 疾病建模：阿爾茨海默病、自閉癥類器官的長期培養(yǎng)。  

- 藥物篩選：高通量測試神經(jīng)保護(hù)劑的療效。  

附：關(guān)于發(fā)布“腦科學(xué)與類腦研究”國家科技重大專項(xiàng)2025年度項(xiàng)目申報(bào)指南的通告

一、資助模式

申報(bào)單位應(yīng)根據(jù)指南方向的研究內(nèi)容和考核指標(biāo)以項(xiàng)目形式組織申報(bào)，項(xiàng)目分為常規(guī)項(xiàng)目和青年科學(xué)家項(xiàng)目，項(xiàng)目執(zhí)行期一般為5年。

（一）常規(guī)項(xiàng)目。

指南方向1-11為常規(guī)項(xiàng)目。

常規(guī)項(xiàng)目可下設(shè)課題，應(yīng)整體申報(bào)，并覆蓋相應(yīng)指南方向的全部研究內(nèi)容和考核指標(biāo)。除特殊說明外，每個常規(guī)項(xiàng)目下設(shè)課題數(shù)不超過4個，項(xiàng)目（課題）牽頭單位和參與單位總數(shù)不超過7家。常規(guī)項(xiàng)目設(shè)1名負(fù)責(zé)人，每個課題設(shè)1名負(fù)責(zé)人，項(xiàng)目負(fù)責(zé)人可擔(dān)任其中1個課題的負(fù)責(zé)人，項(xiàng)目（課題）負(fù)責(zé)人和項(xiàng)目骨干不多于8人。

常規(guī)項(xiàng)目每個指南方向原則上只支持1項(xiàng)，僅在申報(bào)項(xiàng)目評審結(jié)果相近、技術(shù)路線明顯不同時(shí)，可同時(shí)支持2項(xiàng)，并建立動態(tài)調(diào)整機(jī)制，根據(jù)中期評估結(jié)果擇優(yōu)繼續(xù)支持。

（二）青年科學(xué)家項(xiàng)目。

指南方向12-25為青年科學(xué)家項(xiàng)目。

青年科學(xué)家項(xiàng)目分為A類與B類兩種支持方式，其中A類申請國撥經(jīng)費(fèi)不超過500萬元，B類申請國撥經(jīng)費(fèi)不超過300萬元。青年科學(xué)家項(xiàng)目申報(bào)不需要覆蓋指南方向的全部研究內(nèi)容。每個項(xiàng)目牽頭單位和參與單位總數(shù)不超過2家，鼓勵學(xué)科交叉和聯(lián)合申報(bào)。指南方向下設(shè)2個課題，兩位課題負(fù)責(zé)人的研究方向應(yīng)屬于腦認(rèn)知原理解析、腦重大疾病研究、腦機(jī)接口、類腦計(jì)算等方向中的任何兩個不同方向。青年科學(xué)家項(xiàng)目每個指南方向支持的項(xiàng)目數(shù)量將根據(jù)申請情況確定。申請青年科學(xué)家項(xiàng)目的項(xiàng)目（課題）負(fù)責(zé)人可根據(jù)所發(fā)布的指南方向，結(jié)合自身的研究需求，選擇提出A類或B類申請。

北京基爾比生物公司主營產(chǎn)品：

Kilby 3D-clinostat 三維旋轉(zhuǎn)儀，

Kilby 微/超重力三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，

3D回轉(zhuǎn)重力環(huán)境模擬系統(tǒng)，隨機(jī)定位儀，

類器官芯片搖擺灌注儀，

英國Kirkstall 類器官串聯(lián)芯片灌流仿生構(gòu)建系統(tǒng)