研究設(shè)計(jì)

使用算法和體內(nèi)選擇來(lái)優(yōu)化AGT CDS和UTR序列。

通過(guò)檢測(cè)HEK293T細(xì)胞裂解液中丙酮酸的含量，確認(rèn)轉(zhuǎn)染后蛋白是否具有功能，并通過(guò)免疫熒光確認(rèn)AGT蛋白的細(xì)胞器定位。

在人類3D肝模型和AGT缺陷動(dòng)物中分別評(píng)估hAGT mRNA的療效。包括在Agxt-/-小鼠和大鼠中的單次給藥、單次給藥聯(lián)合口服維生素B6、乙二醇誘導(dǎo)后的單次給藥以及在Agxt-/-大鼠中的多次給藥（每周一次，共3周）。

研究者在野生型小鼠、大鼠和食蟹猴中設(shè)計(jì)了多劑量給藥的毒理學(xué)研究，檢測(cè)了動(dòng)物的攝食量、體重、體溫、心電圖和血壓、血漿生化、血液學(xué)檢查、血液凝固和免疫學(xué)指標(biāo)。

研究結(jié)果

研究者對(duì)人類AGT蛋白在不同物種中的同源性進(jìn)行了全面分析，發(fā)現(xiàn)其在人類、小鼠、大鼠和食蟹猴中具有高度同源性，這為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供了優(yōu)化基礎(chǔ)。為了優(yōu)化hAGT mRNA的穩(wěn)定性和密碼子使用，研究者應(yīng)用了“LinearDesign”程序，通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬和算法優(yōu)化，對(duì)mRNA序列進(jìn)行了精心設(shè)計(jì)，確保其在體內(nèi)的穩(wěn)定性和高效表達(dá)。隨后，研究者將優(yōu)化后的mRNA序列包裝在LPP中，以實(shí)現(xiàn)高效的體內(nèi)遞送。在眾多優(yōu)化的mRNA序列中，2770 hAGT mRNA脫穎而出，它不僅表現(xiàn)出最高的密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）值，還具有適中的最小自由能（MFE）值，這使得它在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中成為研究者的主要候選序列。

在體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，2770 hAGT mRNA在HEK293T細(xì)胞中展現(xiàn)出高效的蛋白表達(dá)能力，且顯著高于其他候選序列。進(jìn)一步地，研究者篩選了非翻譯區(qū)（UTR）組合，以增強(qiáng)mRNA在肝臟中的翻譯效率。經(jīng)過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，研究者發(fā)現(xiàn)UTR1組合的hAGT mRNA在大鼠肝臟中能夠產(chǎn)生最高的蛋白表達(dá)水平。此外，研究者對(duì)LPP遞送系統(tǒng)進(jìn)行了表征，結(jié)果顯示其粒徑均勻，約為87.2 nm， PDI為0.04，包封率超過(guò)90%，平均zeta電位為-10.36 mV，這些物理特性確保了LPP能夠在體內(nèi)穩(wěn)定地?cái)y帶并遞送mRNA。在穩(wěn)定性研究中，研究者發(fā)現(xiàn)hAGT mRNA/LPP在4℃和-20℃下儲(chǔ)存4周后，其PDI和粒徑仍能保持相對(duì)穩(wěn)定，但在25℃下則會(huì)出現(xiàn)顯著增加，這提示研究者在實(shí)際應(yīng)用中需要嚴(yán)格控制儲(chǔ)存溫度。多次凍融循環(huán)后，粒徑、包封率和純度均無(wú)顯著變化，這表明研究者的制劑具有良好的凍融穩(wěn)定性，能夠滿足實(shí)際應(yīng)用中的多次凍融需求。

通過(guò)免疫熒光染色技術(shù)，研究者觀察到轉(zhuǎn)染hAGT mRNA/LPP的HEK293T細(xì)胞中，AGT蛋白主要分布在過(guò)氧化物酶體中，與其正常的生理功能相符合。酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這一觀察結(jié)果，隨著mRNA轉(zhuǎn)染含量的增加，細(xì)胞內(nèi)丙酮酸濃度逐漸上升。這表明AGT蛋白在轉(zhuǎn)染后能夠正常發(fā)揮其酶活性，催化相應(yīng)的生化反應(yīng)，為后續(xù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供了細(xì)胞水平的驗(yàn)證。

研究者成功構(gòu)建了人類PH1肝臟3D模型，這一模型能夠模擬體內(nèi)肝臟的組織結(jié)構(gòu)和功能，為研究PH1的病理機(jī)制和治療方法提供了理想的平臺(tái)。將構(gòu)建好的3D模型轉(zhuǎn)染hAGT mRNA/LPP后，研究者發(fā)現(xiàn)hAGT mRNA在模型中具有較高的表達(dá)水平，這表明研究者的轉(zhuǎn)染方法在3D模型中同樣有效。更重要的是，草酸積累量在轉(zhuǎn)染后顯著減少，與正常肝臟3D模型的草酸含量接近，這一結(jié)果直接證明了hAGT mRNA/LPP在恢復(fù)肝臟正常代謝功能方面的潛在療效。通過(guò)免疫熒光染色，研究者還觀察到AGT蛋白在3D模型中的表達(dá)可持續(xù)5天，且細(xì)胞未出現(xiàn)明顯損傷，這為后續(xù)的長(zhǎng)期治療研究提供了希望。

在野生型Balb/c小鼠中，研究者詳細(xì)研究了hAGT mRNA/LPP的藥代動(dòng)力學(xué)特性。結(jié)果顯示，在小鼠肝臟和血液中，hAGT mRNA的表達(dá)在注射后6小時(shí)達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，48小時(shí)后趨于低水平，這表明mRNA在體內(nèi)的表達(dá)具有一定的時(shí)效性。在AgxtQ84-/-大鼠中，hAGT mRNA的表達(dá)趨勢(shì)與小鼠相似，且在1 mg/kg和2 mg/kg劑量下，6小時(shí)后的表達(dá)量分別為野生型大鼠的8倍和70倍，這一結(jié)果不僅驗(yàn)證了研究者的遞送系統(tǒng)在不同物種中的有效性，還為后續(xù)的藥效學(xué)研究提供了合適的劑量范圍。Western blot和免疫組化結(jié)果進(jìn)一步顯示，在大鼠肝臟中，hAGT蛋白在48小時(shí)內(nèi)高表達(dá)，96小時(shí)后仍可檢測(cè)到，這表明研究者的mRNA替代療法能夠在體內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生具有功能的AGT蛋白。在食蟹猴中，hAGT mRNA在肝臟中的表達(dá)在第一次和第三次注射后的48小時(shí)達(dá)到高峰，144小時(shí)后仍可檢測(cè)到，這一結(jié)果提示研究者的療法在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中也具有良好的表達(dá)效果，為未來(lái)的臨床試驗(yàn)提供了重要的參考數(shù)據(jù)。

討論

本研究系統(tǒng)地評(píng)估了mRNA蛋白替代療法在兩種不同的PH1模型中的安全性和有效性。通過(guò)CDS和UTR序列優(yōu)化，研究者篩選出高表達(dá)的hAGT mRNA模板，并選擇LPP遞送系統(tǒng)以實(shí)現(xiàn)mRNA在肝臟中的持續(xù)表達(dá)。藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，AGT蛋白在144小時(shí)內(nèi)持續(xù)表達(dá)，Agxt-/-小鼠、Agxt-/-大鼠以及PH1患者來(lái)源的類器官均證實(shí)了hAGT mRNA/LPP的治療效果。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)hAGT mRNA/LPP在2 mg/kg劑量下僅產(chǎn)生適度的不良反應(yīng)。

研究者觀察到未來(lái)臨床試驗(yàn)應(yīng)用的局限性。盡管研究者延長(zhǎng)了AGT蛋白活性的持續(xù)時(shí)間，頻繁注射限制了其潛在應(yīng)用。此外，PEG抗體的存在可能進(jìn)一步阻礙更高劑量mRNA蛋白替代療法的改進(jìn)。

結(jié)論

通過(guò)結(jié)合mRNA設(shè)計(jì)與LPP遞送系統(tǒng)，研究者成功延長(zhǎng)了蛋白表達(dá)的持續(xù)時(shí)間，并在多種PH1疾病動(dòng)物模型中降低了尿草酸水平。mRNA/LPP系統(tǒng)在嚙齒動(dòng)物和靈長(zhǎng)類動(dòng)物中均表現(xiàn)出安全性和耐受性。研究者的臨床前實(shí)驗(yàn)為mRNA蛋白替代療法在PH1患者中的治療潛力提供了有希望的證據(jù)。