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干貨 | 雙熒光素酶驗證轉(zhuǎn)錄因子與啟動子區(qū)調(diào)控作用
轉(zhuǎn)錄因子是一類參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要調(diào)節(jié)因子。不同轉(zhuǎn)錄因子的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域識別不同基因啟動子區(qū)特定的堿基序列，行使抑制或激活該基因轉(zhuǎn)錄的功能。將目的基因啟動子區(qū)域（通常取轉(zhuǎn)錄起始位點TSS 上游-2000bp）、或針對結(jié)合位點進行突變、或分段截斷序列，構(gòu)建到報告基因載體luciferase 的上游，共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)質(zhì)粒，通過熒光素酶活反映轉(zhuǎn)錄因子對啟動子活性的調(diào)控作用。
圖1.轉(zhuǎn)錄因子與啟動子調(diào)控示意圖
常用載體：pGL3-Basic 、pGL3-Promoter
圖2 .載體信息
翌圣雙熒光素酶報告基因檢測服務(wù)流程
客戶提供 | 翌圣服務(wù) | 客戶所得 |
1、待研究啟動子基因詳細(xì)信息 2、轉(zhuǎn)錄因子詳細(xì)信息 | 1、轉(zhuǎn)錄因子和啟動子結(jié)合位點預(yù)測 2、方案設(shè)計、引物設(shè)計與合成 3、序列合成、質(zhì)粒構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 4、熒光素酶活性檢測 | 1、項目所得質(zhì)粒及菌液 2、中間樣品 3、完整項目報告 |
實驗步驟
目的細(xì)胞質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)預(yù)實驗
當(dāng)選擇在目的細(xì)胞（而非293 工具細(xì)胞）中進行驗證實驗時，首先要確認(rèn)目的細(xì)胞的質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)效率，以及摸索合適的瞬轉(zhuǎn)體系，質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)效率>40%以上時表明預(yù)實驗通過。
目的細(xì)胞質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)預(yù)實驗
a. 將狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的空白細(xì)胞用0.25%胰酶消化，用wanquan培養(yǎng)基懸浮成
單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)后，接種于24 孔培養(yǎng)板中；
b. 培養(yǎng)過夜，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。在細(xì)胞覆蓋率70%左右時，進行轉(zhuǎn)染實驗；
c. 轉(zhuǎn)染2 h 前換液為新鮮的培養(yǎng)基；
d. 轉(zhuǎn)染取無菌的1.5 mL EP 管，按照轉(zhuǎn)染試劑使用說明進行轉(zhuǎn)染復(fù)合物配置
e. 轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞樣品。
報告基因檢測
細(xì)胞樣品收集
a. 轉(zhuǎn)染后從培養(yǎng)箱中取靶細(xì)胞，輕輕吸凈培養(yǎng)液，PBS 洗滌2 次；
b. 棄去PBS，每孔加入100μL 的1×PLB（5X Passive Lysis Buffer 用無菌水稀釋而得）；
c. 細(xì)胞裂解后，將樣品轉(zhuǎn)移入Ep 管中，-80 度冰箱保存。
根據(jù)報告基因檢測試劑盒說明書操作進行檢測
a. 將充分裂解后的裂解產(chǎn)物，10,000-15,000 rpm 離心3-5 min。離心后將上清液移入新的EP 管進行后續(xù)檢測。
b. Renilla Luciferase Assay 工作液的配置：按照樣品要求的量，將Renilla Luciferase Assay Reagent(100×)按照稀釋比例加入Renilla Luciferase Assay buffer，混勻后室溫放置。
c. 熒光素酶檢測：
按照儀器說明書要求將熒光檢測打開，設(shè)定參數(shù)，測定時間為10 s，測定間隔為2 s；將樣品按照20 μL 的體積加入測量管中（保持每次樣品的加樣量一致），另外加入20 μL Firefly Luciferase Assay Reagent 混勻2-3 次（不能漩渦混勻），充分混勻后測定RLU（Relative light unit），同時設(shè)置Cell Lysis buffer 為空白對照孔；將檢測后的樣品，加入20 μL 配制的Renilla Luciferase Assay 工作液混勻2-3 次，充分混勻后測定RLU，同時設(shè)置Renilla Luciferase Assay 工作液為空白對照孔。
數(shù)據(jù)處理與分析，計算相對熒光強度
提供原始實驗數(shù)據(jù)與完整實驗報告
常規(guī)檢測分組
（1）過表達(dá)對照+啟動子對照+海腎內(nèi)參(TK)
（2）過表達(dá)對照+啟動子野生型+海腎內(nèi)參(TK)
（3）過表達(dá)對照+啟動子突變型+海腎內(nèi)參(TK)
（4）轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)+啟動子對照+海腎內(nèi)參(TK)
（5）轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)+啟動子野生型+海腎內(nèi)參(TK)
（6）轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)+啟動子突變型+海腎內(nèi)參(TK)
實驗預(yù)期結(jié)果
轉(zhuǎn)錄因子促進靶基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性
轉(zhuǎn)錄因子抑制靶基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性
翌圣可提供雙熒光素酶報告基因檢測服務(wù)，加快基礎(chǔ)研究及藥物篩選進度
服務(wù)類型 | 客戶提供 | 服務(wù)內(nèi)容 | 周期 |
雙熒光素酶驗證miRNA 與靶基因3’UTR 相互作用 | 1、miRNA基因及物種（具體的ID信息） 2、靶基因基因及物種 3. 結(jié)合位點信息 | 1、miRNA與3’UTR結(jié)合位點預(yù)測 2、方案設(shè)計、引物設(shè)計合成 3、miRNA mimics合成、質(zhì)粒構(gòu)建 4、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及報告基因檢測
| 25-30個工作日 |
雙熒光素酶驗證lncRNA 與miRNA 相互作用 | 1、lcnRNA基因及物種 2、miRNA基因及物種（具體的ID信息） 3、結(jié)合位點信息 | 1、lncRNA 與miRNA結(jié)合位點預(yù)測 2、方案設(shè)計、引物設(shè)計合成 3、miRNA mimics合成、質(zhì)粒構(gòu)建 4、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及報告基因檢測 | 25-30個工作日 |
雙熒光素酶驗證轉(zhuǎn)錄因子與啟動子區(qū)調(diào)控作用 | 1、啟動子信息（名稱、物種、序列） 2、啟動子基因模板（或委托我司合成/克?。?/span> 3、 實驗用細(xì)胞（若選用293T細(xì)胞無需提供） | 1、轉(zhuǎn)錄因子與啟動子結(jié)合位點預(yù)測 2、方案設(shè)計、引物設(shè)計合成 3、序列合成、質(zhì)粒構(gòu)建 4、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及報告基因檢測 | 30-35個工作日 |
信號通路分析 | 通路下游的響應(yīng)元件序列 | 1、方案設(shè)計、引物設(shè)計合成 2、序列合成、質(zhì)粒構(gòu)建 | 30-35個工作日 |
SNP 活性分析 | 基因的啟動子區(qū)域存在單核苷酸多態(tài)性（SNP)信息 | 1、方案設(shè)計、引物設(shè)計合成 2、序列合成、質(zhì)粒構(gòu)建 | 30-35個工作日 |
相關(guān)產(chǎn)品清單
產(chǎn)品類別 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 | 產(chǎn)品規(guī)格 |
雙熒光素酶報告基因檢測試劑 | Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit 雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒 | 11402ES60/80 | 100T/1000T |
Dual Glo Luciferase Reporter Gene Assay Kit 輝光型雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒 | 11405ES60/80 | 100T/1000T | |
轉(zhuǎn)染試劑 | Hieff Trans® Liposomal Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑 | 40802ES01/03 | 100μL/1mL |
Hieff Trans® in vitro siRNA/miRNA Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑 | 40806ES01/02/03 | 0.1mL/0.5mL /1mL | |
Hieff Trans® mRNA Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑 | 40809ES01/03 | 0.1mL/1mL |
相關(guān)產(chǎn)品
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