前言

類器官已成為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的“明星模型”，在疾病機(jī)制研究、藥物篩選、精準(zhǔn)醫(yī)療等方面展現(xiàn)出巨大潛力。然而，許多科研人員在嘗試類器官培養(yǎng)時(shí)，常常面臨“無(wú)法形成結(jié)構(gòu)”、“細(xì)胞活性低”、“傳代失敗”等問(wèn)題。

探究其根本，培養(yǎng)體系中細(xì)胞因子的選擇和配比可能是成敗的關(guān)鍵！

接下來(lái)，我們將會(huì)結(jié)合類器官經(jīng)典培養(yǎng)方案WENR（Wnt3a、EGF、Noggin、R-Spondins），解析“四大護(hù)法”如何各顯神通，助你攻克類器官培養(yǎng)難關(guān)！

01 WENR何以成為類器官培養(yǎng)經(jīng)典？

類器官的經(jīng)典培養(yǎng)方案WENR（或稱為WNER）最初由荷蘭Hubrecht研究所的Hans Clevers團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)，其核心成分包括Wnt-3a、EGF、Noggin和R-Spondins。常被稱為類器官培養(yǎng)的“四大護(hù)法”。

WENR方案在類器官的研究與實(shí)踐中不斷演化，通過(guò)與其他細(xì)胞因子或小分子抑制劑的巧妙結(jié)合，衍生出適用于多種類器官構(gòu)建的培養(yǎng)條件。目前，WENR方案已在胃、小腸、結(jié)腸、胰腺、肝臟等多種類器官培養(yǎng)中得到廣泛應(yīng)用。

WENR方案用于多種類器官培養(yǎng)（源自Bindi M. Doshi, PhD.）

02 WENR“四大護(hù)法”

1 Wnt-3a：干細(xì)胞增殖的“發(fā)動(dòng)機(jī)”

Wnt-3a作為經(jīng)典Wnt通路的激活劑，通過(guò)穩(wěn)定β-catenin蛋白，啟動(dòng)下游靶基因（如c-Myc、Cyclin D1），參與細(xì)胞發(fā)育、增殖和分化過(guò)程。Alessandra Merenda在其綜述中深入總結(jié)了Wnt信號(hào)通路在類器官領(lǐng)域的關(guān)鍵作用。文中指出，無(wú)論成體干細(xì)胞組織來(lái)源如何，其衍生的類器官在增殖、干性維持及終末分化特化細(xì)胞等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，都依賴于經(jīng)典Wnt信號(hào)通路。如在小鼠結(jié)腸類器官的建立過(guò)程中，添加外源性Wnt-3a對(duì)其增殖至關(guān)重要。不添加Wnt-3a，類器官超過(guò)3天后無(wú)法存活。

Wnt-3a在腸類器官中培養(yǎng)中的作用（源自文獻(xiàn)：doi: 10.1016/j.tcb.2019.10.003）

2 EGF：細(xì)胞增殖的“加速器”

表皮生長(zhǎng)因子（EGF）與受體結(jié)合，激活MAPK/ERK通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活。EGF刺激上皮細(xì)胞增殖、血管生成和表皮細(xì)胞分化，促進(jìn)類器官三維結(jié)構(gòu)的形成。EGF廣泛應(yīng)用于胃腸道、肝臟、甲狀腺等類器官培養(yǎng)，促進(jìn)細(xì)胞集落形成和組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。盡管EGF并非類器官形成的必需因子，但能顯著增加類器官體積。

優(yōu)化的WENR方案在人胃腸道類器官構(gòu)建過(guò)程中的應(yīng)用（源自文獻(xiàn)：doi: 10.1186/s13619-020-00040-w）

3 Noggin：抑制分化的“守門員”

在類器官構(gòu)建過(guò)程中，Noggin與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。Noggin是一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）的內(nèi)源性抑制劑，通過(guò)阻斷BMP與受體結(jié)合，促進(jìn)干細(xì)胞增殖，為類器官形成提供充足的細(xì)胞。Noggin還通過(guò)抑制BMP信號(hào)通路，維持干細(xì)胞干性，影響細(xì)胞的命運(yùn)決定和分化過(guò)程。

在類器官培養(yǎng)中，Noggin常與Wnt-3a和R-Spondins一起使用，以平衡BMP和Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)類器官的生長(zhǎng)和分化。因此，Noggin在類器官培養(yǎng)中不僅促進(jìn)增殖，還精細(xì)調(diào)控細(xì)胞的分化。

Noggin抑制細(xì)胞增殖的分子機(jī)制（源自文獻(xiàn)：doi: 10.1242/bio.20149977）

4 R-Spondins：Wnt信號(hào)的“放大器”

R-spondin是Wnt信號(hào)通路的激活劑，通過(guò)與Frizzled和LRP5/6受體結(jié)合，增強(qiáng)Wnt信號(hào)在多種組織中的表達(dá)，促進(jìn)干細(xì)胞增殖與類器官結(jié)構(gòu)形成。T. Thalheim等人發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有R-spondin時(shí)，類器官在4-5天后停止生長(zhǎng)。在1.2% R-spondin濃度下培養(yǎng)的類器官生長(zhǎng)非常迅速，生長(zhǎng)時(shí)間超過(guò)5天后經(jīng)常破裂，其管腔內(nèi)積累了大量細(xì)胞碎片。在10%或25% R-spondin濃度下培養(yǎng)的類器官生長(zhǎng)速度比1.2%稍慢，但不會(huì)破裂。

不同濃度的R-spondin影響腸類器官的生長(zhǎng)狀態(tài)（源自文獻(xiàn)：doi: 10.1016/j.ydbio.2017.10.013）

03 WENR實(shí)戰(zhàn)避坑Tips

Wnt過(guò)度激活會(huì)導(dǎo)致類器官結(jié)構(gòu)紊亂，因此Wnt-3a濃度需嚴(yán)格控制。并且R-spondin需要和Wnt-3a協(xié)同使用，單獨(dú)使用效果有限。建議根據(jù)類器官類型優(yōu)化Wnt-3a的濃度，一般為50-100 ng/mL。在培養(yǎng)后期也可以動(dòng)態(tài)調(diào)控其濃度。

EGF易被蛋白酶降解，建議使用無(wú)血清培養(yǎng)基。EGF長(zhǎng)期高濃度，可能會(huì)誘導(dǎo)異常分化，建議定期更換培養(yǎng)基。EGF一般使用濃度為50 ng/mL。在腫瘤類器官（如腸癌）中，其濃度需根據(jù)癌細(xì)胞特性調(diào)整。

Noggin與Wnt-3a協(xié)同作用，支持胃、腸道、肝臟、肺、胰腺等類器官的長(zhǎng)期培養(yǎng)。在肺類器官培養(yǎng)中，Noggin缺失會(huì)導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞過(guò)早分化。在肝類器官中，其與Wnt3a的“雙劍合璧”是長(zhǎng)期傳代的關(guān)鍵。BMP信號(hào)的過(guò)度激活會(huì)導(dǎo)致類器官形成囊狀結(jié)構(gòu)，失去功能性隱窩結(jié)構(gòu)。

S-spondin有4個(gè)亞型（RSPO1-4），不同組織來(lái)源的類器官可能需特異性選擇。Wnt-3a和R-spondin易失活，建議分裝后-80℃保存。

常見(jiàn)問(wèn)題排查表，僅供參考：

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【參考文獻(xiàn)】

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