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ELISA檢測方法原理、操作步驟及常見問題

來源:南京億迅生物科技有限公司   2025年03月17日 15:36  

ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)是一種廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷的實驗技術(shù)。由于其高靈敏度和具體性,ELISA已成為檢測抗體、激素、蛋白質(zhì)和病原體的方法。


一、ELISA檢測原理

基本原理


ELISA依賴于特定的抗原與抗體之間的親和作用。實驗中,抗體或抗原先被固定在微孔板上,然后添加待測樣本,使其與固定的生物分子發(fā)生反應(yīng)。通過鏈接有酶的二抗,使目標(biāo)物質(zhì)產(chǎn)生信號,信號的強度與目標(biāo)物質(zhì)的量成正比,通過光度計測量這些信號來定量分析樣品中的成分。


方法類型

  • 直接ELISA:使用直接標(biāo)記有酶的抗體對抗原進(jìn)行檢測。
  • 間接ELISA:使用兩種抗體,第一抗體特異地識別抗原,第二抗體識別第一抗體并標(biāo)記有酶。
  • 夾心ELISA:利用兩種抗體夾住抗原,其中一種固定,另一種標(biāo)記有酶。
  • 競爭ELISA:抗原和標(biāo)記有酶的抗原競爭同一抗體的結(jié)合位。

二、實驗前的準(zhǔn)備

實驗材料


執(zhí)行ELISA實驗需要以下關(guān)鍵材料和試劑:


  • 抗體:選擇高特異性和親和力的抗體。
  • 酶標(biāo)記底物:常用的酶如辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP),底物選擇應(yīng)與酶相匹配。
  • 洗滌液:通常使用含有Tween-20的PBS緩沖液以減少非特異性結(jié)合。
  • 阻斷液:用于阻斷微孔板中未被抗體或抗原占據(jù)的位點,防止非特異性吸附。

設(shè)備與環(huán)境

  • 酶標(biāo)儀:用于讀取酶反應(yīng)產(chǎn)生的光信號。
  • 實驗室環(huán)境:需要保持清潔,溫度和濕度控制適中以保證實驗的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

三、操作步驟詳解

1. 樣品準(zhǔn)備

  • 處理:取所需樣品體積,如有必要,進(jìn)行適當(dāng)稀釋以符合測試范圍。

  • 存儲:將樣品分裝在避光小管中,存放于-20°C以下以避免降解。避免反復(fù)凍融,建議分裝成單次使用量。

2. 加樣與孵育

  • 加樣:在微孔板中加入50 µL樣品到每個測試孔中。使用多通道移液器可以提高效率和準(zhǔn)確性。

  • 孵育:將孔板覆蓋,放置在37°C孵育器中孵育1小時,或根據(jù)抗體配套文件推薦的時間進(jìn)行孵育。

3. 洗滌

  • 洗滌次數(shù):用自動洗板機(jī)或手動洗板,每次加入300 µL洗滌緩沖液,靜置幾秒后棄液,重復(fù)此過程至少3次。

  • 洗滌技巧:確保每次洗滌液充分覆蓋孔底,避免泡沫產(chǎn)生,因泡沫可能導(dǎo)致孔間污染。

4. 酶標(biāo)底物加入和信號發(fā)展

  • 底物加入:向每個孔中加入100 µL酶底物(如TMB),在避光條件下室溫孵育15-30分鐘。

  • 終止反應(yīng):加入50 µL的終止液(如2N硫酸),反應(yīng)立即停止,并將顏色由藍(lán)變黃。

5. 讀取結(jié)果

  • 使用酶標(biāo)儀:在450 nm波長下讀取吸光度值。如果可能,讀取650 nm作為參考波長,以校正板材不均或泡沫的影響。


四、注意事項與經(jīng)驗分享

常見問題及對策

  • 孔板交叉污染:使用新的吸頭和適當(dāng)?shù)募夹g(shù),如慢速釋放液體到孔壁,避免液體直接沖擊到孔底。

  • 底物不穩(wěn)定:底物開封后應(yīng)避光保存,并在推薦的有效期內(nèi)使用,過期底物可能導(dǎo)致信號弱或背景高。

經(jīng)驗技巧

  • 提高靈敏度:優(yōu)化底物的孵育時間,觀察顏色變化,避免過度孵育導(dǎo)致信號飽和。

  • 減少非特異性背景:增加阻斷步驟的時間或使用高效的阻斷劑,如脫脂牛奶粉或BSA,以填補未被抗體或抗原占據(jù)的微孔板表面。


隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展,我們可以預(yù)見到ELISA技術(shù)將變得更加自動化和敏感,未來可能引入更多的數(shù)字化和微流控技術(shù),以進(jìn)一步提高其準(zhǔn)確性和效率。這些改進(jìn)將為臨床診斷和生物醫(yī)學(xué)研究提供更強大的支持。

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