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抗體快速發(fā)現(xiàn)—基于CFPS的高通量抗體篩選方案
小鼠雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體（mAb）具有耗時長、局限于特定動物物種的缺點，另外，B細胞和骨髓瘤伴侶的融合效率低限制了單克隆抗體的復現(xiàn)機會。而噬菌體、酵母、哺乳動物細胞展示技術(shù)中，親本文庫是通過重鏈和輕鏈基因的隨機組合構(gòu)建的，免疫反應中一些體內(nèi)重鏈和輕鏈庫會丟失，非自然可變區(qū)對無法有效結(jié)合，導致可用的抗體很少。這些技術(shù)方案的瓶頸，制約了抗體篩選研究的發(fā)展。
單B細胞+CFPS高通量篩選方案
單B細胞篩選技術(shù)可以利用免疫動物的單個B細胞快速生成mAb，是獲得天然抗體庫的有力技術(shù)。其中，mAb的重組生產(chǎn)通常是用動物細胞（如CHO和HEK 293）瞬時表達系統(tǒng)進行的，而動物細胞中的轉(zhuǎn)染和表達至少需要3~5天，這極大限制限制了抗體篩選速度。
無細胞蛋白表達（CFPS）為mAb表達提供了一種新方式。該技術(shù)通過將細胞內(nèi)的RNA聚合酶、核糖體及轉(zhuǎn)錄翻譯輔助因子等合成蛋白所需要的分子機器提取出來，并輔以核苷酸、氨基酸、能量物質(zhì)及基因模板，在沒有活細胞參與的體外直接合成蛋白質(zhì)。
CFPS在高通量重組蛋白表達方面相比體內(nèi)表達方法具有顯著優(yōu)勢：
1
CFPS無需基因克隆、轉(zhuǎn)染、細胞培養(yǎng)、細胞裂解，流程簡單、表達快速；
2
CFPS允許高通量表達，且便于實現(xiàn)自動化，可適配高通量移液工作站進行高通量、自動化抗體表達，更節(jié)省人力成本；
3
CFPS開放性、可控性強，允許添加輔助蛋白折疊的酶，促進抗體上清可溶表達。
圖1 哺乳動物細胞表達篩選與CFPS高通量篩選流程示意圖
單B細胞+CFPS高通量篩選案例
目前，已有報道通過單B細胞建立抗體庫以及CFPS表達mAb的篩選方案，在2天內(nèi)完成了抗原特異性mAb的篩選。該方案包括從免疫兔的外周血中收集B細胞、通過抗原包被的磁珠和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)染色選擇B細胞、基于單細胞的PCR、在CFPS中生產(chǎn)mAb以及CFPS產(chǎn)物直接進行ELISA實驗。
圖2 利用CFPS從單B細胞中快速篩選單克隆抗體的Ecobody技術(shù)
（一）B細胞篩選與分離
研究人員從用滅活副溶血性弧菌免疫的兔子的幾毫升血液中采集6.8×106個淋巴細胞，用ER追蹤器對細胞進行染色，并通過熒光激活細胞分選（FACS）收集到約2.0×104個細胞顯示強熒光的細胞。隨后，將涂有滅活副溶血性弧菌的磁珠加入細胞混合物中，用磁鐵分離與抗原結(jié)合的約500個細胞，其中19個用于單細胞PCR。每10µL分離一個細胞到384孔板中，并在倒置相差顯微鏡下選擇和確認細胞-磁珠復合物。
（二）單細胞RT-PCR
使用基因特異性引物和SuperScript IV逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄。第一次 PCR使用與信號肽(SP)序列和抗體基因恒定區(qū)退火的引物，第二次 PCR使用帶有后續(xù)Gibson組裝步驟所需尾巴的引物。
以上環(huán)節(jié)在第一天完成。
（三）構(gòu)建CFPS模板與CFPS反應
通過Gibson組裝將T7啟動子和終止子與抗體基因結(jié)合，然后通過PCR擴增DNA片段，用于無細胞蛋白合成。
為了增強Hc和Lc的正確配對，研究人員還開發(fā)了一種名為“Zipbody”的改良Fab形式。即設(shè)計亮氨酸拉鏈(LZ) LZA和LZB，分別融合在Hc和Lc的C端。此外，還在N端添加短肽序列標簽Ser-Lys-Ile-Lys(SKIK)，以提高蛋白表達水平。
隨后，使用DsbC和氧化谷胱甘肽（GSSG）通過CFPS表達帶有SKIK標簽的Zipbody。
（四）ELISA實驗
首先通過SDS-PAGE的熒光成像確認了這些基因的蛋白質(zhì)表達。然后，CFPS產(chǎn)物直接進行ELISA實驗。所有以 Zipbody形式表達并包含 SKIK 標簽的克隆對副溶血性弧菌的結(jié)合活性均高于對其他測試抗原（大腸桿菌 O157、O26、O111或BSA）的結(jié)合活性（圖 3a）。
圖3 Ecobody技術(shù)獲得的mAb的ELISA評估
（五）案例總結(jié)
該方法不需要將DNA轉(zhuǎn)染到活細胞中，也不需要細胞培養(yǎng)來進行體內(nèi)蛋白質(zhì)表達，只需將大腸桿菌細胞提取物與模板DNA（PCR片段）、氨基酸、核苷酸、T7 RNA聚合酶和能量源混合，即可在60至90分鐘內(nèi)獲得mAb，整個篩選過程比使用動物細胞表達的方法顯著簡化。此外，通過比較純化蛋白的WB和ELISA信號的條帶強度，該實驗10 μL CFPS體系中mAb平均產(chǎn)量約為0.3 μg，即30 μg/mL。CFPS中mAb的表達量足夠通過ELISA進行篩選，從而使過去可能因表達量不足被認為活性低而被忽略的陽性克隆可以得到合理的評估。
珀羅汀生物CFPS抗體表達
珀羅汀生物自主知識產(chǎn)權(quán)的無細胞蛋白表達（CFPS）系統(tǒng)支持多條肽鏈的自主組裝，可實現(xiàn)VHH、scFv等抗體分子以及全長抗體IgG的上清可溶表達。已有ELISA實驗結(jié)果表明，珀羅汀生物CFPS系統(tǒng)表達的抗體具備高免疫活性。
珀羅汀生物CFPS抗體表達案例一
圖4 某IgG與Fab片段SDS-PAGE圖及其ELISA活性（CFPS）
珀羅汀生物CFPS抗體表達案例二
圖5 某兩個VHH（左）與scFv（右）的SDS-PAGE圖（CFPS）
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