在細胞生物學領域，長非編碼RNA（lncRNA）因其在調(diào)控細胞過程中的復雜作用而備受關注，特別是它們在調(diào)控細胞分裂等關鍵生物過程中所扮演的角色。這些分子不僅參與調(diào)控細胞分裂的精細過程，還與基因組穩(wěn)定性密切相關。但lncRNAs的具體功能和作用機制，仍是科研領域的未解之謎。

最近，一項發(fā)表在《Nature Communications》上的研究，利用高內(nèi)涵細胞成像技術結合siRNA文庫篩選方案，為我們揭示了lncRNA在細胞分裂中的重要作用。接下來就跟小編儀器深入探究這項研究是如何巧妙地利用高內(nèi)涵細胞成像篩選技術結合siRNA文庫策略，成功挖掘出一篇影響因子高達12+的學術文章的奧秘吧！

研究背景

細胞分裂是生物體生長和維持組織功能的基礎。在這一過程中，染色體的準確分配至子細胞是至關重要的。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在細胞周期、分化、增殖和凋亡等多種細胞過程中扮演著調(diào)控者的角色。然而，大多數(shù)lncRNA的生物學功能仍然是一個謎。

研究方法

該研究由英國倫敦大學瑪麗皇后學院Lovorka Stojic研究組聯(lián)合劍橋大學Fanni Gergely及Duncan T. Odom研究組，通過靶向2000多個人類lncRNAs的高內(nèi)涵RNAi成像篩選，鑒定了許多參與細胞分裂關鍵步驟的lncRNAs，如染色體分離、有絲分裂持續(xù)時間和胞質分裂。并揭示了與基因組穩(wěn)定性有關的幾種lncRNAs，以及控制微管行為并具有細胞分裂以外功能的lncRNA。

研究思路

01

siRNA文庫轉染，利用高內(nèi)涵篩選表型,發(fā)現(xiàn)LncRNA在細胞分裂不同階段具有功能，例如有絲分裂，染色體分離，胞質分裂；

為了鑒定參與調(diào)節(jié)細胞分裂的lncRNAs，研究人員進行了兩次連續(xù)的RNAi篩選（篩選A和B），即將靶向2231個人類lncRNAs的siRNA文庫轉染HeLa細胞，并使用高內(nèi)涵篩選有絲分裂表型以檢查其效果。

02

確定相關LncRNA,對相關LncRNA的作用做進一步確認,使用不同表征方法；

03

利用RNA-Seq,對比RNAi和LNA介導LncRNA的功能缺失細胞中,基因轉錄差異。鑒定出linc00899相關的TPPP蛋白高表達。對TPPP高表達是否影響有絲分裂時間進行驗證,并對linc00899和TPPP之間的相互作用關系進行驗證；

04

TPPP作用于微管,所以研究linc00899對紡錘體中微管動態(tài)變化的控制。主要通過表型進行對比；

05

linc00899和TPPP之間的調(diào)控在不同細胞系的有絲分裂過程中均存在。linc00899和TPPP之間的調(diào)控分類,屬于trans,只有在內(nèi)源linc00899過表達時才能抑制TPPP的表達

主要發(fā)現(xiàn)

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研究發(fā)現(xiàn)linc00899這一染色質相關的lncRNA，在多種細胞類型中，其耗竭會導致明顯的有絲分裂延遲。

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通過轉錄組分析linc00899耗竭的細胞，研究團隊鑒定出神經(jīng)元微管結合蛋白TPPP/p25作為linc00899的靶標。

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linc00899與TPPP/p25結合并抑制其轉錄，當linc00899耗竭時，TPPP/p25的上調(diào)改變了微管動力學并延遲了有絲分裂。

研究意義

這項研究不僅展示了lncRNA在維持基因組穩(wěn)定性中的多重角色，而且還揭示了linc00899通過控制微管行為來調(diào)控有絲分裂的新穎機制。這對于我們理解lncRNA在細胞周期進程中的功能以及它們在人類疾病，特別是癌癥中的作用具有重要意義。

技術亮點

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本文中利用了瑞孚迪（Revvity）的Opera高內(nèi)涵細胞成像技術結合siRNA文庫篩選方案，為研究lncRNA在復雜生物過程中的作用提供了一個強大的工具。

傳統(tǒng)的RNAi篩選技術通常只能針對單個或少量基因進行分析，而高內(nèi)涵RNAi篩選技術則能夠在單一實驗中同時分析數(shù)千個lncRNAs的功能。利用這一技術，可對大量lncRNAs在細胞分裂過程中的作用進行系統(tǒng)性篩選，并通過圖像分析算法對細胞的形態(tài)和分裂情況進行定量分析。這些數(shù)據(jù)經(jīng)過標準化處理后，利用統(tǒng)計方法可快速篩選出對細胞分裂具有顯著影響的lncRNAs。

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瑞孚迪的Opera平臺可提供高分辨率的細胞成像，捕捉細胞分裂過程中的細微變化。搭配Columbus軟件可進行自動化圖像分析流程，快速處理大量數(shù)據(jù)，識別關鍵細胞表型變化。

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這篇研究使用的The Lincode siRNA Library由Dharmacon提供，Dharmacon siRNA產(chǎn)品有如下特點：

SMARTselectionTM技術——高度特異性，確保沉默效率

SMARTpoolTM技術——無需驗證，保證至少75％靶基因沉默效率

雙鏈修飾技術，有效減少off-target并進一步提升沉默效率

在功能基因組學的研究中，瑞孚迪可提供了一系列的解決方案，包括高內(nèi)涵成像篩選系統(tǒng)、基因編輯技術、siRNA文庫、高通量篩選平臺等，這些工具和技術服務幫助科研人員更深入地理解基因的功能和基因間的相互作用，加速了從基礎研究到臨床應用的轉化。