食品致病菌污染是嚴(yán)重威脅人類健康的問題，用于快速、準(zhǔn)確控制食品質(zhì)量的生物傳感器得到了廣泛的研究。

       建立了基于多參數(shù)表面等離子體共振(MP-SPR)生物傳感器檢測乳制品中鼠傷寒沙門菌的方法。利用生物催化沉淀法進(jìn)一步改進(jìn)了利用捕獲抗體直接檢測細(xì)菌的方法。對照樣品的檢出限(LOD)為10² CFU/mL， 真實樣品(奶粉)的檢出限為10³ CFU/mL，表明該生物傳感器具有較高的靈敏度。

概述

       目前使用的沙門氏菌檢測方法包括培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 。這些方法通耗時，需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理和訓(xùn)練有素的人員，因此正在積極開發(fā)更強(qiáng)大和易于使用的方法。

       表面等離子體共振(SPR)是一種成熟的方法，用于測量結(jié)合親和力和動力學(xué)。創(chuàng)新的多參數(shù)表面等離子體共振(MP-SPR)儀器可以在非常寬的角度范圍(40-78度)和多個波長進(jìn)行測量，從而允許從小分子相互作用到細(xì)菌，細(xì)胞和病毒的實時檢測的廣泛應(yīng)用。

       MP-SPR是生物傳感器開發(fā)的良好的方法，無論您的傳感器是基于MP-SPR檢測還是您正在開發(fā)新的便攜式(護(hù)理點)生物傳感器。MP-SPR的優(yōu)點是靈敏度高，無標(biāo)記檢測。它還允許直接在您選擇的材料上開發(fā)傳感器:金屬電極電化學(xué)、孔板分析用塑料、印刷生物傳感器用纖維素、傳統(tǒng)化學(xué)用玻璃、SERS納米粒子等，避免分析轉(zhuǎn)移步驟。傳感器載片可以很容易地在原位和非原位進(jìn)行修改，提供了廣泛的功能化可能性(CVD, ALD，自旋涂層，浸漬涂層等)。此外，MP-SPR允許測量真實樣品(牛奶，血清，尿液，海水等)，不像許多傳統(tǒng)的SPR儀器。在MP-SPR測量后，可以用AFM等其他方法進(jìn)一步表征傳感器表面。這得益于MP-SPR的無油操作，使用了涂有光學(xué)彈性體的棱鏡。

材料和方法

       本研究采用BioNavis MP-SPR Navi™210 VASA儀器，流速為20 μL/min。用2 M NaCl和10 mM NaOH溶液清洗CMD3D傳感器載玻片5分鐘，然后用EDC (200 mM)和NHS (50 mM)的混合物活化羧基7分鐘。引入捕獲抗體(和BSA作為參考通道)(10 μg/mL，在50mM醋酸緩沖液中，pH 4.5)，然后用乙醇胺(1 M, pH 8.5, 5分鐘)阻斷剩余的反應(yīng)基團(tuán)。為了進(jìn)一步阻斷，注射牛血清白蛋白(2 mg/mL, HBS-P)和1%奶粉，HBS-P。

       將奶粉(Laktino)用HBS-P緩沖液稀釋至1%的濃度。不同濃度的腸沙門氏菌(亞種)。經(jīng)培養(yǎng)和熱處(80°C/30min)后加入樣品中。處理過的細(xì)菌濃度以CFU/mL表示，對應(yīng)于處理前的活細(xì)胞。

       細(xì)菌注射10分鐘，然后注射10分鐘辣根過氧化物酶抗體偶聯(lián)物(HRP- ab2)和沉淀底物溶液(HRP)(圖1)。生物催化反應(yīng)將4-氯-1-萘酚轉(zhuǎn)化為不溶性苯并4-氯環(huán)己二酮。檢測限(LOD)是根據(jù)信噪比來評估的，其中可測量的最小信號電平必須比噪聲電平高三倍。

圖1：多參數(shù)表面等離子體共振(MP-SPR)檢測奶粉中沙門氏菌。辣根過氧化物酶抗體2 (HRP-Ab2)特異性結(jié)合沙門氏菌和沉淀物的形成。

結(jié)果和討論

       該生物傳感器首先在Biacore 3000 SPR儀器上開發(fā)，LOD達(dá)到10⁴ CFU/mL。為了進(jìn)一步改進(jìn)生物傳感器，選擇了生物催化沉淀反應(yīng)來提高靈敏度。然而，辣根過氧化物酶需要使用乙醇。Biacore儀器與醇不兼容，不像BioNavis MP-SPR儀器，它對有機(jī)溶劑具有優(yōu)異的抵抗力。因此，選擇MP-SPR Navi™210A VASA進(jìn)行進(jìn)一步研究。

       利用MP-SPR儀器，成功開發(fā)了一種生物傳感器，生物催化沉淀將沙門氏菌檢測限(LOD)從10⁴ CFU/mL提高到10² CFU/mL(圖2)。在含有捕獲抗體和細(xì)菌的通道中，結(jié)合水平很高，而在參比通道(處理過的BSA)中僅形成少量沉淀。沙門氏菌結(jié)合多個HRP-Ab2偶聯(lián)物，隨著微生物濃度的增加，生物傳感器的靈敏度呈指數(shù)級提高。與直接結(jié)合法相比，HRP-Ab2結(jié)合物對沙門氏菌具有特異性，也提供了更高的選擇性。該傳感器與革蘭氏陰性菌大腸桿菌K-12的交叉反應(yīng)性測試表明，其結(jié)合可忽略不計。以MP-SPR傳感器載玻片的光學(xué)顯微鏡和AFM圖像為參照，均證實生物傳感器表面有細(xì)菌附著和沉淀形成(圖3)。

圖2。沙門氏菌的檢測是基于抗體(HRP-Ab2)與細(xì)菌的結(jié)合和辣根過氧化物酶的生物催化沉淀。幾個HRP-Ab2結(jié)合在一個細(xì)菌上導(dǎo)致信號呈指數(shù)級擴(kuò)增。

圖3。緩沖液中不同濃度細(xì)菌引起的生物催化沉淀(上圖)和實際樣品奶粉中的細(xì)菌檢測(下圖)。原子力顯微鏡圖像證實了細(xì)菌附著和沉淀物的形成。

       MP-SPR的總分析時間為60分鐘，明顯短于其他細(xì)菌檢測方法，如培養(yǎng)(~d)、ELISA (~10 h)和PCR (~h)。

       細(xì)菌的結(jié)合不僅對生物傳感器的發(fā)展很有意義，而且對材料科學(xué)也很有意義。MP-SPR已被用于表征功能性“自衛(wèi)”抗菌植入物涂層(Cado et al.， 2013)。涂層通過病原體刺激釋放抗微生物肽。在這里，MP-SPR測量多層膜的形成并量化吸附質(zhì)量。

結(jié)論

       MP-SPR是一種高靈敏度、高選擇性的生物傳感器，可用于檢測食品樣品中的細(xì)菌。例如，MP-SPR對于食品和飼料安全、環(huán)境安全、臨床診斷、邊界和過程控制等方面的檢測開發(fā)具有不可估量的價值。在生物傳感器開發(fā)中使用MP-SPR的主要好處是: 與有機(jī)溶劑的相容性，易于修改傳感器表面，能夠處理原始樣品。