在微生物研究，尤其是細(xì)菌學(xué)中，對菌體計數(shù)是一項最基本的需求。常規(guī)的計數(shù)方法主要是國家標(biāo)準(zhǔn)推薦的平板計數(shù)法和顯微鏡計數(shù)法，但它們耗時長、誤差大，且平板法只能計數(shù)活菌。

近年來，隨著熒光染料、結(jié)構(gòu)光學(xué)和流式細(xì)胞儀技術(shù)的不斷發(fā)展，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)菌等微生物成為可能。與傳統(tǒng)檢測方法相比，其具有靈敏、快速、高效、精確的優(yōu)勢，流式細(xì)胞術(shù)已經(jīng)成為微生物研究中的一個重要工具，在單細(xì)胞層面對細(xì)菌結(jié)構(gòu)和功能的多項參數(shù)進(jìn)行更深層的分析，以研究細(xì)菌的異質(zhì)性和鑒定細(xì)菌種屬。

本方案以大腸桿菌為例，介紹層浪流式細(xì)胞儀如何評估活菌比例和計數(shù)。

——實驗背景——

膜的完整性評估是細(xì)菌活力的重要評價手段，通常使用膜滲透性和非滲透性熒光染料來進(jìn)行活力測試，目前比較常見的染料是SYTO 9/PI。

SYTO 9 作為一種可滲透的綠色熒光核酸染料，被動擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，既可以進(jìn)入細(xì)胞膜完整的細(xì)菌中，也可以進(jìn)入細(xì)胞膜受損的細(xì)菌中，與核酸染料結(jié)合。而紅色熒光核酸染料PI只能進(jìn)入不完整細(xì)胞膜的細(xì)菌中。當(dāng)SYTO 9和PI同時加的時候，PI染料進(jìn)入膜內(nèi)，會導(dǎo)致SYTO 9熒光染料的降低。因此，具有完整細(xì)胞膜的細(xì)菌呈現(xiàn)綠色，而膜不完整的細(xì)菌呈現(xiàn)紅色。


圖1：SYTO 9/PI細(xì)菌活力測定法原理示意圖

——樣本處理——

1. 收集對數(shù)生長期的大腸桿菌，10000g，5min，離心洗滌，取細(xì)胞沉淀重懸于0.22um過濾的無菌PBS中；

2.進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)，為后續(xù)染色做準(zhǔn)備；

3. 取4個流式管，標(biāo)記為空白組，SYTO 9和PI單染組，樣本組。每個試管加100ul細(xì)菌懸液，保證細(xì)菌數(shù)在10⁶-10⁷左右。

——樣本染色——

1. 根據(jù)廠家試劑盒建議，單染組分別加1ul SYTO 9或1ul PI，樣本組加1ul SYTO 9和1ul PI，加PBS至988ul。渦旋，室溫避光孵育15min；

2. 充分渦旋微球，每管分別加10ul，每份樣本中體系為1000ul；

3. 設(shè)置參數(shù)，用層浪FongCyte流式細(xì)胞儀采集信號，SYTO 9（Max Ex/Em=485/498nm）用FITC通道檢測，PI（Max Ex/Em=535/617nm）用PerCP通道檢測，兩個通道光譜重疊小，補(bǔ)償易調(diào)節(jié)。

——數(shù)據(jù)分析——

1. 細(xì)菌比較小，選擇對數(shù)模式分析。設(shè)置合適的電壓，使細(xì)菌群信號在流式圖中間清晰地呈現(xiàn)。設(shè)置合適的閾值，很大程度減少背景噪音。此實驗中，設(shè)置的是FSC和FITC雙閾值；

2. 根據(jù)FSC和SSC，圈出主細(xì)菌，右上角的一群是微球（圖2）；

3. 從主細(xì)菌中，選擇SYTO 9和PI，紅光區(qū)域的代表死菌，綠光區(qū)域的代表活菌（圖3）。

——總結(jié)——

1. 原核生物平均直徑在1um左右，需要挑選合適的流式細(xì)胞儀。層浪的流式細(xì)胞儀檢測直徑在0.1-50um，除大腸桿菌外，還可以檢測葡萄球菌、酵母、浮游生物、益生菌等；

2. 層浪流式細(xì)胞儀可以獲得體積法絕dui計數(shù)，跟微球法結(jié)果有較高的一致性，節(jié)約實驗經(jīng)費；

3. 細(xì)菌活力染色實驗對管路的潔凈度要求高，層浪流式細(xì)胞儀每管樣本間采樣針自動清洗，攜帶污染率為0.05%，能夠獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)果。

數(shù)據(jù)來源 : 廣州某實驗室

層浪： 您好，可以采訪下您近期使用層浪流式細(xì)胞儀的感受嗎？

客戶： 可以的。

層浪：  在層浪的儀器上，您們?nèi)粘６甲瞿男颖荆?/span>

客戶：  我們實驗室開展多種流式實驗，在微生物方面，除了細(xì)菌，還做酵母、益生菌檢測等。

層浪：  您對于層浪的儀器，有哪些使用感受和反饋嗎？

客戶：  我們之前用平板法培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行計數(shù)，這種方式只能培養(yǎng)活菌，通常耗時3天左右，而流式細(xì)胞術(shù)對活菌和死菌都可以計數(shù)，比平板法的計數(shù)結(jié)果會高一些，更準(zhǔn)確一些，而且靈敏、檢測速度快、時間短，極大地提高了我們出數(shù)據(jù)的效率，我們現(xiàn)在逐漸用流式替代平板法了。

層浪：  確實，現(xiàn)在流式細(xì)胞儀在微生物研究中的作用越來越廣泛了。

客戶：  我們實驗室之前有一款進(jìn)口的流式細(xì)胞儀，現(xiàn)在使用貴司的儀器，非常喜歡您們的軟件！中文的界面，功能鍵直觀，而且操作簡單。細(xì)菌實驗對儀器的清潔度要求高，還要避免管路之間的交叉污染，之前我們是上完一個樣本，再上一管水，進(jìn)行反沖。而您們的儀器每個樣本之間能夠進(jìn)行采樣針清洗，免去了我們每管樣本手動清洗的麻煩。做普通清洗和深度清洗也很方便，使用的清洗液用量也不大。

層浪：  非常感謝您的反饋。層浪會繼續(xù)努力，用心服務(wù)每一位客戶。


圖4：層浪生物FongCyte™3光14色流式細(xì)胞儀

參考文獻(xiàn)：

1、劉新星,霍轉(zhuǎn)轉(zhuǎn).流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)菌快速檢測中的應(yīng)用；微生物學(xué)通報。DOI:10.13344/j.microbiol.China.130041.

2、鄧穎,基于流式細(xì)胞術(shù)的SYTO 9/PI細(xì)菌活性判定方法優(yōu)化及其機(jī)理;暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文.

3、Philipp Stiefel, Sabrina Schmidt-Emrich,Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.DOI 10.1186/s12866-015-0376-x.

4、S M Stocks,Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight.doi: 10.1002/cyto.a.20069.

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