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PCR的工作機制
PCR由一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，包含前、中、后三個階段。最重要的化學(xué)變化是熱循環(huán)期間的產(chǎn)物合成。每次循環(huán)后產(chǎn)物、模板、聚合酶、引物和脫氧核苷酸的余量都會改變，處于連續(xù)的不穩(wěn)定狀態(tài)。所有的循環(huán)都是從模板和先前產(chǎn)物的變性開始。當(dāng)溫度較低時，引物退火到模板上。
早先若干循環(huán)的退火步驟要求引物尋找正確的染色體模板作為它們的目標。在中期的循環(huán)中，先前合成的產(chǎn)物優(yōu)先成為模板。最后幾個循環(huán)中，增擴后的高濃度產(chǎn)物互相雜交，由此阻止與引物的雜交。
引物退火后，Taq DNA聚合酶把自己定位到引物和模板綜合體上，提取介質(zhì)中的自由dNTPs然后沿著模板延伸。從本質(zhì)上講，引物和模板的任何反應(yīng)都會造成產(chǎn)物擴展，它們的特異性在最初的幾個循環(huán)中可能很難控制，得到非特異性產(chǎn)物的摩爾量超過在模板上正確退火位置的量。PCR反應(yīng)特異性的可靠度依賴于2個引物必須定位到互補的DNA鏈上。進一步講，退火溫度和Mg2+離子的濃度影響引物穩(wěn)定的雜交到模板上，雜交位置間距應(yīng)小于10kb。
相比之下，增擴階段的大部分循環(huán)里，模板被很好的與先前增擴的片段區(qū)分開。這些片段的數(shù)量取決于早先若干個循環(huán)的嚴密性。甄選同源性引物的退火位置是較簡單的，增擴期間由染色體DNA貢獻的有效的模板數(shù)量只是可以忽略一小部分。甄選的復(fù)雜性被超量由引物從互補位點新增擴的片段所降低。
PCR的化學(xué)計量
熱力學(xué)方面的影響對PCR來講是試劑濃度和模板間的對應(yīng)關(guān)系。在起先的循環(huán)中PCR試劑的摩爾比率是最高的，隨著PCR產(chǎn)物的增加而降低。令人驚訝的是這種減低是由增擴的目標分子的增加引起的而不是由于試劑的消耗。最初剩余的引物和脫氧核苷酸與模板的比率是固定的，反應(yīng)結(jié)束后，dNTP的濃度下降超過1倍，引物任然剩余95%，Taq DNA聚合酶沒有變化。增擴千萬倍目標分子后，模板分子遠多于酶分子。當(dāng)產(chǎn)物增加后，酶全部被占用了，引物和模板的比率減低，推動自身退火。當(dāng)自身退火的數(shù)量增加或酶的總量有時，反應(yīng)處于飽狀態(tài)并停止指數(shù)級的增長。增擴階段是自我受限的。這個階段之后，熱循環(huán)轉(zhuǎn)向未在最初幾個循環(huán)中被選擇的欺騙性的目標增擴，盡管能夠通過提高開始時Taq DNA聚合酶和引物的含量來維持高試劑比率，但這種修改很可能引起丟失特異性因為引物會胡亂雜交，出現(xiàn)額外的條帶和斑點。
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