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技術(shù)指南 | 瓊脂糖凝膠電泳詳解

來源:上海信裕生物科技有限公司   2021年10月26日 16:30  
01

電泳的發(fā)展簡史



1809

國外物理學(xué)家Рейсе發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象
1909

將膠體離子在電場(chǎng)中的移動(dòng)稱為電泳
1937

創(chuàng)造了Tiselius電泳儀,建立了研究蛋白質(zhì)的移動(dòng)界面電泳方法,并證明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白組成的。

1948

Wieland和Fischer重新發(fā)展了以濾紙作為支持介質(zhì)的電泳方法,對(duì)氨基酸的分離進(jìn)行過研究。
1950

Durrum用紙電泳進(jìn)行了各種蛋白質(zhì)的分離以后,開創(chuàng)了利用各種固體物質(zhì)(如各種濾紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂凝膠、淀粉凝膠等)作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳方法。
1959

Raymond和Weintraub利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì),創(chuàng)建了聚丙烯酰胺凝膠電泳,極大地提高了電泳技術(shù)的分辨率,開創(chuàng)了近代電泳的新時(shí)代。
02

電泳的基本原理

電泳是指帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物分子,如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可電離基團(tuán),它們?cè)谀硞€(gè)特定的pH值下可以帶正電或負(fù)電,在電場(chǎng)的作用下,這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動(dòng)。電泳技術(shù)就是利用在電場(chǎng)的作用下,由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異,使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù)。

03

瓊脂糖凝膠電泳

1.瓊脂糖凝膠電泳原理:瓊脂糖凝膠具絡(luò),物質(zhì)分子通過時(shí)到阻力,大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大,因此在凝膠電泳中,帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量,而且還取決于分子大小,這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相比于蛋白質(zhì)太大,對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)來說其分子篩效應(yīng)微不足道,現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中。瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳最主要區(qū)別是:心兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。

2.瓊脂糖凝膠電泳用途:用于DNA切膠回收;用于DNA分離;用于佐證DNA是否重組、質(zhì)粒是否切開以及其他分子生物學(xué)研究

3.瓊脂糖凝膠電泳特點(diǎn):

I、優(yōu)點(diǎn):

  • 因不含硫酸根和羧基,幾乎消除了瓊脂的電滲

  • 對(duì)蛋白質(zhì)吸附極微,故無拖尾現(xiàn)象。

  • 凝膠結(jié)構(gòu)均勻,孔徑較大,可用來分離酶的復(fù)合物、核酸、病毒等大分子物質(zhì)。

  • 透明度較好,可直接或干燥成薄膜后進(jìn)行染色。

  • 不吸收紫外光,可直接利用紫外光吸收法作定量測(cè)定

  • 有熱可逆性

II、缺點(diǎn):

  • 機(jī)械強(qiáng)度差,易破碎,濃度不能太低。

  • 易被細(xì)菌污染,不易保存,臨用前配制。

  • 瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴(kuò)散,電泳后必須立即固定染色。

  • 與PAGE相比,分子篩作用小,區(qū)帶少。

04

瓊脂糖凝膠電泳操作步驟
01
配膠
圖片

1.制備1%瓊脂糖凝膠(大膠用70ml,小膠用50ml):稱取0.7 g(0.5 g)瓊脂糖置于錐形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小燒杯.微波爐加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化,搖勻,即成1.0%瓊脂糖凝膠液.

02
制膠板
圖片

取電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi)槽(制膠槽)洗干凈,晾干,放入制膠玻璃板.取透明膠帶將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好,形成模子.將內(nèi)槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上,使膠液緩慢展開,直到整個(gè)玻璃板表面形成均勻膠層.室溫下靜置直至凝膠*疑固,垂直輕拔梳子,取下膠帶,將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中.添加

03
加樣
圖片

在點(diǎn)樣板或pa rafi lm上混合DNA樣品和上樣緩沖液,上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1X.用10ul微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi),每加完一個(gè)樣品,應(yīng)更換一個(gè)加樣頭,以防污染,加樣時(shí)勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面.(注意:加樣前要先記下加樣的順序).

04
電泳
圖片

加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳,電壓60-100V,樣品由負(fù)極(黑色)向正極(紅色)方向移動(dòng).電壓升高,瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低.當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板下沿約1cm處時(shí),停止電泳.


05

影響瓊脂糖凝膠電泳因素
  1. DNA分子的大小

  2. 凝膠的濃度

  3. DNA的構(gòu)象

  4. 使用的電壓

  5. 瓊脂糖的種類

  6. 電泳緩沖液

  7. 嵌入染料的存在

以上這些因素都會(huì)對(duì)電泳產(chǎn)生影響,具體詳細(xì)內(nèi)容就不在這里給大家一一介紹了,以后大家遇到什么問題的話,都可以從這幾方面入手去找問題



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