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| IHC信號微弱/無信號 | |
| 問題 | 解決方案 |
| 抗體效力 | a. 抗體效價不高?？赏ㄟ^增加抗體使用濃度，延長抗體孵育時間進行調整。 b. 所用抗體不適用于IHC實驗。建議在非變性WB上測試該抗體，以確保抗體識別非變性抗原，或是選用通過IHC實驗驗證的抗體。 c. 一抗二抗不匹配。使用針對一抗物種來源的二抗，如一抗宿主為rabbit，則須使用anti-rabbit的二抗。 d. 抗體失活。避免將標記熒光基團的二抗放置于光照環(huán)境。 |
| 酶底物失活或呈色時波長設置錯誤 | a. 顯色溶液失去作用，可能是由于底物緩沖液中含有酶抑制劑，或底物緩沖液的pH值不適當。建議取一滴二抗標記酶與底物溶液反應, 可確認顯色溶液是否失去活性。 b. 錯誤的激發(fā)波長。呈色前確保激發(fā)波長與使用的熒光基團相匹配。 |
| 樣品制備問題 | a. 脫蠟作用不足。建議延長脫蠟時間，使用新鮮配制的二甲苯。 b. 固定液（福爾馬林或 PFA) 可能改變表位。建議利用抗原修復方式使表位暴露出來或縮短固定作用的時間。 c. 固定作用不適當。避免延遲固定或過度固定，一般建議至少固定6小時以上，18~24小時已可滿足大多數(shù)實驗應用。 d. 冰凍切片樣品保存期過長。冰凍切片制備完成后，最好于1-2個月內用完，超過6個月的話，建議制備新的玻片。 e. 熒光染色樣品保存不當。熒光基團在光線下暴露時間過長，可能會導致信號減弱，建議在避光環(huán)境下進行實驗和保存樣品，也可使用防熒光淬滅的封片劑封固樣本。 |
| 樣品屬性 | a. 靶蛋白含量低。建議設置為陽性対照組，增加抗體使用量或利用放大步驟來放大信號。 b. 靶蛋白為核蛋白而抗體不能穿透細胞核。建議在封閉溶液與抗體稀釋液中加入滲透試劑，以促進抗體滲透到細胞內。 c. 靶蛋白為膜蛋白而表位可能因為滲透作用被破壞或移除。建議將緩沖液中的滲透試劑減少或移除。 d. 較厚的組織。如斑馬魚全胚胎或染色建議做細胞破膜，以便抗體順利進入胞內與相應抗原結合。 關鍵步驟：在每次的實驗中，設置陽性與陰性對照組，以確認是該次實驗的抗體、試劑、組織切片、實驗過程的問題，還是靶蛋白自身表達量低的問題。 |
| IHC非特異性染色/背景值比較高 | |
| 問題 | 解決方案 |
| 固定方式或組織自身可能存在自發(fā)熒光 | a. 嘗試用非醛類替代醛類。 b. 用淬滅自發(fā)熒光的染料或方法處理組織樣品：如硼氫化na、短波長的UV照射、蘇丹黑等。 c. 將石蠟包埋樣品的方法換成冰凍切片（OCT或明膠），減少固定液的影響。 d. 選擇不會與自發(fā)熒光競爭的熒光染料。福爾馬林、PFA或戊二醛等會產生高背景的熒光，尤其在使用綠色、藍色和紅色波長光譜范圍時；組織中的紅細胞或膠原蛋白等組分會產生很強的自發(fā)熒光，尤其是使用綠色和紅色通道的熒光檢測時。 e. 組織沖洗不*，有固定液殘留。 f. 使用福爾馬林或PFA固定過久。一般建議至少固定6小時以上，18~24小時已可滿足大多數(shù)實驗應用，注意：如固定時間到了無法繼續(xù)后續(xù)脫水、包埋程序，一定要將組織置換到PBS保存，切勿一直泡于固定液中，否則有可能造成蛋白交聯(lián)無法修復。 g. 配置新鮮的固定液 |
| 封閉、洗脫或顯色問題 | a. 增加封閉液濃度、延長封閉時間。 b. 更換封閉液成分，注意: 封閉液成分不可與一抗物種同來源，最好與二抗物種同源，如二抗來自馬血清，使用馬血清可得到較干凈的背景。 c. 底物過量：縮短底物孵育時間。 d. 信號過度放大：縮短信號放大試劑孵育時間。 e. 洗脫液不適合：如果原本是用PBS，可更換使用TBS |
| 抗體濃度太高或非特異性結合 | a. 降低抗體濃度，如1：100調整為1：1000。 b. 縮短抗體孵育時間，并在4°c 孵育。 c. 增加封閉緩沖液濃度。 d. 做多個目標蛋白染色時，建議使用預吸附二抗減少與其他物種一抗的交互作用。 e. 針對二抗與組織發(fā)生非特異性結合的情況建議每次實驗都要設置一組不加一抗，只加二抗的對照組，才能確認信號是來自高背景值還是真實信號。 |
| 內源性酶（過氧化氫酶或堿性磷酸酶） | a. 使用酶抑制劑。 - 過氧化物酶：使用H2O2 (0.3% v/v) - 堿性磷酸酶：使用 Levamisol (2 mM) |
| 內源性生物素 | 與 Avidin 孵育以封閉生物素 |
| 組織問題 | a. 脫蠟不*，可能導致細胞核染色在呈相時模糊，亦可能導致抗體無法辨認抗原或者高背景值。 b. 抗原修復方式不適合，建議更換修復溶液成分或方法。 c. 一抗與組織物種同源。較常發(fā)生在使用鼠源抗體染鼠源組織時，除了避開同樣物種來源的一抗和組織之外，也可以使用 Mouse-on-Mouse IHC染色試劑盒 (GTX83396) 迸行實驗。 d. 任何時候都不要讓組織干掉。 |
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