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產(chǎn)品簡介：

巴貝斯蟲屬（Babesia spp.）主要是通過蜱蟲傳播寄生于動物宿主紅細(xì)胞內(nèi)的原蟲，它主要引起人和動物的巴貝蟲病，屬于人獸共染的寄生蟲病。人巴貝蟲病，急性發(fā)病時頗似瘧疾，臨床以間歇熱、脾大、黃疸及溶血等為特征。目前已經(jīng)有 100 種以上的巴貝斯蟲得到鑒定，是人和動物健康的重大威脅，因此快速檢測巴貝斯蟲具有重要的意義。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測巴貝斯蟲的通用的試劑盒。

產(chǎn)品特點：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏度高，可以達(dá)到 100 拷貝/反應(yīng)。

3.提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據(jù)巴貝斯屬通用 DNA 高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他生物的 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。

5.In silico 分析發(fā)現(xiàn)本產(chǎn)品可以檢測 B. venatorum、B. divergens、B. capreoli 和 B.canis 等大巴貝斯，但不能檢測 B. microti。

6.既用于定性檢測，又用于定量檢測。定量檢測時線性范圍至少 5 個數(shù)量級。

7.本產(chǎn)品足夠 50 次 20 μL 體系的探針法熒光定量PCR 反應(yīng)。

8.巴貝斯屬通用探針法熒光PCR試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

50T/盒，可滿足一定規(guī)模的檢測需求。

檢測方法

實時熒光PCR，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點。

試劑盒成分

2×Probe qPCR MasterMix、熒光 PCR 專用模板稀釋液、超純水、巴貝斯屬通用 qPCR 引物-探針干粉、巴貝斯屬通用 qPCR 陽性對照(1E7 拷貝/μL)、使用手冊。

自備試劑

樣品 DNA，超純水，核酸純化試劑盒。

保存和運輸

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 24 個月。

使用方法：

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 1E1-1E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本

產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。

1.標(biāo)記 6 個離心管，分別為 6、5、4、3、2、1。

2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3.在 6 號管中加入 5 μL 1E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1

分鐘，得 1E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在 4 號管中加入 5 μL 1E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7.如果有 N 個樣品，最好設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性

對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10 μL 上步所得 4 號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC 另外用水作為 NC。

8.用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)樣品 DNA -提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的核酸-提取試劑。

三、Probe qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（直接用第 6 步第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好

后最后加）：

成分樣品管

N+2 個PCR 陰性

對照標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管

（1-6 管）

2×Probe qPCR MasterMix各 10 μL10 μL各 10 μL

巴貝斯屬通用 qPCR

引物-探針混合液各 3 μL3 μL各 3 μL

N+2 個待測 DNA 樣本各 7 μL不加不加

超純水不加7 μL不加

第 6 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液

（1-6 號）

不加

不加各 7 μL（2 號樣到 2 號管，3

號樣到 3 號

管…）

四、數(shù)據(jù)處理

12.如果樣本制備陽性對照或PCR 陽性對照(包括標(biāo)曲樣本)結(jié)果為陰性，則整個實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重新樣本制備，重新進行 PCR 擴增或跟廠家聯(lián)系。如果樣本制備陰性對照或 PCR 陰性對照結(jié)果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系。

13.如果陰性對照和陽性對照均正常，則實驗有效，可以進入后續(xù)分析。

14.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照必須無 Ct 或 Ct 大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應(yīng)該小于 40，否則實驗無效。如果實驗有效，則分析待測樣品，如果無 Ct 或 Ct 大于

或等于 40，則為陰性。如果 Ct 小于 40 則為陽。

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