在細胞生物學(xué)研究中，對細胞膜進行熒光標記和示蹤是觀察細胞行為、分析細胞相互作用以及研究細胞遷移和分布的重要手段。DiR (DiIC18(7))作為一種近紅外熒光的親脂性染料，憑借其染色機制和優(yōu)異的性能，成為細胞膜標記領(lǐng)域的理想選擇。
DiR 是一種親脂性、近紅外熒光花青染料，其兩個 18-碳鏈能夠深入插入細胞膜的脂質(zhì)雙層中。這種特性使得 DiR 能夠?qū)崿F(xiàn)對細胞膜的特定且穩(wěn)定的染色。當 DiR 與細胞膜結(jié)合后，其熒光強度顯著增強，同時光穩(wěn)定性也得到顯著提升。這種熒光增強效應(yīng)歸因于 DiR 分子與細胞膜脂質(zhì)雙層的緊密相互作用。
DiR 的熒光信號穩(wěn)定，不易受到光漂白的影響，這使得它在長時間的觀察和檢測中表現(xiàn)出色。此外，DiR 對細胞的毒性極低，通常不會影響細胞的正常生理功能和生存力，適用于活細胞的長期示蹤和觀察。DiR 發(fā)出的近紅外熒光具有較高的組織穿透能力，這使得它在體內(nèi)實驗中能夠更深入地觀察細胞的分布和遷移情況。
DiR 最常見的應(yīng)用是對細胞膜進行標記，以觀察細胞的形態(tài)和行為。在細胞標記實驗中，將細胞與 DiR 染色液混合孵育，DiR 分子會迅速插入到細胞膜中并發(fā)出熒光。通過熒光顯微鏡可以清晰地觀察到細胞膜的輪廓和形態(tài)變化。
DiR 標記的細胞膜熒光信號均勻且穩(wěn)定，能夠長時間保持熒光強度，適用于多種細胞類型，包括貼壁細胞和懸浮細胞。標記后的細胞可以用于后續(xù)的細胞培養(yǎng)、細胞遷移實驗和細胞相互作用研究等。
DiR 被廣泛用于細胞示蹤實驗，特別是在深部組織的成像研究中。由于其近紅外熒光特性，DiR 標記的細胞在體內(nèi)實驗中能夠更深入地被觀察，揭示細胞在生物體內(nèi)的分布、遷移和存活情況。在腫瘤研究中，DiR 標記的腫瘤細胞被用于觀察腫瘤的轉(zhuǎn)移路徑和侵襲行為，為腫瘤治療策略的開發(fā)提供了重要數(shù)據(jù)支持。
此外，DiR 還可以用于標記和追蹤其他類型的細胞，如免疫細胞、干細胞等。在干細胞研究中，DiR 標記的干細胞被移植到宿主體內(nèi)后，可以通過熒光成像技術(shù)實時觀察干細胞的歸巢、分化和再生能力，為干細胞治療的臨床應(yīng)用提供了重要的實驗依據(jù)。
在進行 DiR 染色之前，需要準備好細胞樣本。對于貼壁細胞，可以使用胰蛋白酶消化收集細胞，然后用適當?shù)木彌_液洗滌細胞，去除殘留的培養(yǎng)基成分。對于懸浮細胞，直接收集細胞并進行洗滌。將細胞調(diào)整到合適的濃度，一般為 1×10^5 - 1×10^6 cells/mL，以便于后續(xù)的染色和檢測。
將準備好的細胞與 DiR 染色液混合，DiR 的常用工作濃度為 1 - 10 μM。將混合后的細胞懸液置于 37℃、5% CO? 的細胞培養(yǎng)箱中孵育 10 - 20 分鐘。在孵育過程中，DiR 分子會插入到細胞膜中，產(chǎn)生近紅外熒光。孵育時間可根據(jù)細胞類型和實驗需求進行優(yōu)化，以獲得最佳的染色效果。
孵育完成后，用 PBS 輕輕洗滌細胞兩次，去除未結(jié)合的染料。對于需要進行細胞膜標記觀察的樣本，將標記后的細胞接種到培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，加入適量的培養(yǎng)基，放入細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。對于需要進行細胞示蹤實驗的樣本，將標記后的細胞用于后續(xù)的體內(nèi)或體外實驗。使用熒光顯微鏡進行觀察時，設(shè)置 780 nm 的激發(fā)波長和 810 nm 左右的發(fā)射波長檢測通道，收集近紅外熒光信號，實現(xiàn)對細胞膜的標記和示蹤。
低細胞毒性：DiR 對細胞的毒性極低，不會顯著影響細胞的正常生理功能，適用于長期的細胞培養(yǎng)和實驗觀察。
良好的細胞膜通透性：DiR 能夠快速穿透細胞膜并插入到脂質(zhì)雙層中，實現(xiàn)對細胞膜的標記。
穩(wěn)定的熒光信號：DiR 嵌入細胞膜后，熒光信號穩(wěn)定，不易受到光漂白的影響，適合長時間的熒光觀察和檢測。
近紅外熒光：DiR 發(fā)出的近紅外熒光具有較高的組織穿透能力，適用于體內(nèi)深部組織的成像研究。
多色熒光標記：DiR 可與其他發(fā)出不同顏色熒光的染料（如 DiO、DiI）聯(lián)合使用，實現(xiàn)多色熒光標記，為復(fù)雜生物過程的研究提供了更全面的視角。
染色濃度優(yōu)化：使用 DiR 時，需根據(jù)細胞類型和實驗需求優(yōu)化染色濃度。濃度過高可能導(dǎo)致細胞膜過度染色或細胞毒性增加，而濃度過低則可能使熒光信號不足。
避光操作：DiR 染料對光敏感，操作過程中應(yīng)盡量減少樣本的光照時間，以防止熒光淬滅。
背景熒光控制：在染色過程中，需確保染色步驟的規(guī)范性，以減少背景熒光。例如，孵育后應(yīng)充分洗滌細胞，去除未結(jié)合的染料。
保存條件：DiR 染料應(yīng)密封保存于干燥、避光的環(huán)境中，避免接觸強光和高溫，以保持其活性和穩(wěn)定性。
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