諾博萊德 Tissue/CellRNA/DNA/ProteinMiniKit

動(dòng)物組織/細(xì)胞RNA/DNA/Protein共提試劑盒

（免lv仿）

動(dòng)物組織細(xì)胞RNA/DNA共提試劑盒核酸提取

目錄號(hào)：91316

產(chǎn)品內(nèi)容

自備試劑

無(wú)水乙chun

保存條件

室溫（15~25℃）

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書的參數(shù)為準(zhǔn)

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

Tissue/CellRNA/DNA/ProteinMiniKit（免lv仿）適用于從各種動(dòng)物組織、細(xì)胞中同時(shí)提取出總RNA、基因組DNA和Protein，提取全程不需要使用lv仿，得到包含總RNA，不需要DNaseI消化，可直接用于RT、RT-PCR、RT-qPCR、RACE、芯片、測(cè)序等。基因組DNA也可以直接用于下游的Southern、mei切、PCR等各種試驗(yàn)。

du特的裂解液迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞RNase/DNase，然后裂解混合物RNA/DNA/Protein同時(shí)通過(guò)一個(gè)gDNA吸附柱，基因組DNA被吸附而RNA/Protein穿透濾過(guò)。gDNA吸附柱上的基因組DNA經(jīng)過(guò)一系列漂洗、洗脫后得到純凈基因組DNA。濾過(guò)的總RNA，先用乙chun調(diào)節(jié)結(jié)合條件，然后轉(zhuǎn)入RNA吸附柱，在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于RNA吸附柱上，接著通過(guò)一系列快速的離心-漂洗-離心-洗脫，得到純凈的總RNA。濾液經(jīng)選擇性沉淀得到Protein。

注意事項(xiàng)

1.采集RNA樣本時(shí)，把新鮮組織樣本浸入RNAsafe(RNA樣品保存液，91115-100)中，可在37℃保存一天，在25℃保存一周，在4℃保存一個(gè)月，在-20℃或者–80℃長(zhǎng)期保存。

2.樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則會(huì)影響RNA的提取得率和質(zhì)量。

3.提取時(shí)，RNA在裂解液MRLPlus中時(shí)不會(huì)被RNase降解，但后續(xù)處理過(guò)程中應(yīng)使用不含RNase的吸頭和器皿。

4.樣品在加入裂解液MRLPlus并勻漿后，可在–80℃保存一個(gè)月以上。

5.所有的溶液應(yīng)該是澄清的，如果環(huán)境溫度低時(shí)溶液可能形成沉淀，此時(shí)不應(yīng)該直接使用，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清。

重要提示：

①第一次使用前,請(qǐng)先在漂洗液RW、70%乙chun、漂洗液WB瓶中加入

zhi定量無(wú)水乙chun，詳見(jiàn)瓶上的標(biāo)簽。

②所有離心步驟均需要在室溫（15~25℃）下進(jìn)行，提取效果更佳！

操作步驟

1.動(dòng)物組織：

a．電動(dòng)勻漿：取新鮮組織10~20mg加入500μl裂解液MRL Plus，電動(dòng)勻漿，直到無(wú)明顯組織塊即可。

b．液氮研磨：液氮研磨組織成細(xì)粉，取10~20mg組織細(xì)粉加入500μl裂解液MRL Plus，劇烈渦旋振蕩，直到無(wú)明顯粉末團(tuán)即可。

c．將裂解物13,000rpm離心3min，沉淀不能裂解的碎片。

d．下接操作步驟3。

2.細(xì)胞

a.懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，加入500μl裂解液MRL Plus（<8x10⁶細(xì)胞）,吹打混勻，劇烈渦旋振蕩20sec，充分裂解。

b.貼壁細(xì)胞：不需要消化，吸棄培養(yǎng)基后，直接在培養(yǎng)皿/板中加裂解液MRLPlus（每<8x10⁶細(xì)胞加500μl裂解液MRLPlus）進(jìn)行消化、裂解；或者，先用胰mei消化后離心收集細(xì)胞，然后加入裂解液MRL Plus，吹打混勻，劇烈渦旋振蕩20sec，充分裂解。

c.下接操作步驟3。

3.將裂解勻漿物（或離心得到的上清）全部加入gDNA吸附柱中（吸附柱放入收集管中），13,000rpm離心1min，基因組DNA被吸附在膜上，保留濾液（RNA/Protein在濾液中）。

把gDNA吸附柱放入2.0ml離心管，置于4℃度，以備提取DNA用。

以下是總RNA的提取步驟：

4.向?yàn)V液中加入等體積的70%乙chun，用移液器吹打混勻。

5.每次轉(zhuǎn)移≤750μl濾液混合物至RNA吸附柱中，13,000rpm離心1min，此時(shí)，RNA被吸附在膜上，保留濾液，以備提取Protein。

濾液中含有Protein，請(qǐng)轉(zhuǎn)入一個(gè)合適大?。ㄖ辽?倍濾液體積）的離心管，用于步驟18開(kāi)始的Protein提取。

6.加入700μl去蛋白液RW1，室溫放置1min,13,000rpm離心30sec，倒棄濾液。

7.加入500μl漂洗液RW（檢查是否已加入乙chun），13,000rpm離心30sec，倒棄濾液。

8.重復(fù)步驟7。

9.將RNA吸附柱放回空收集管中，13,000rpm離心2min，除去膜上殘留的乙chun。

10.取出RNA吸附柱，放入RNase-free1.5ml離心管中，向RNA吸附膜的中央部位懸空滴加30~50μl的RNase-freeH2O，室溫放置1min，13,000rpm離心1min，管底即總RNA。

11.得到RNA，可直接用于下游實(shí)驗(yàn)，或于-70℃保存，以免降解。

以下是DNA的提取步驟：

12.向步驟3的gDNA吸附柱中，加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm離心30sec，倒棄濾液。

13.加入700μl漂洗液WB（檢查是否已加入乙chun），12,000rpm離心30sec，倒棄濾液。

14.加入500μl漂洗液WB，12,000rpm離心30sec，倒棄濾液。

15.將DNA吸附柱放回空收集管中，13,000rpm離心2min，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙chun抑制下游反應(yīng)。

16.取出gDNA吸附柱，放入新的1.5ml的離心管中，向吸附膜的中央懸空滴加100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在65~70℃水浴中預(yù)熱效果更好），室溫放置3~5min，12,000rpm離心1min。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2min，12,000rpm離心1min。

17.得到的DNA可以存放在2~8℃，如果要長(zhǎng)時(shí)間存放，可以放置在-20℃。

以下是提取Protein的步驟：

18.向步驟5的濾液中加入等體積的緩沖液APP，渦旋振蕩混勻，室溫放置15min沉淀Protein。

19.13,000rpm離心5~10min，小心棄上清。加入0.5ml70%乙chun，顛倒混勻后，離心1min，小心棄上清，留下蛋白沉淀，盡量將殘留液體用移液器吸干凈。

20.室溫晾干沉淀5~10min，注意一定讓乙chun揮發(fā)干凈，以免影響下游試驗(yàn)。

21.將蛋白沉淀溶解于30~150μl1x蛋白上樣緩沖液（如需要蛋白定量，緩沖液中不應(yīng)該加入溴fen蘭）或其它下游試驗(yàn)要求的緩沖液中。

由于裂解液MRLPlus強(qiáng)變性作用或者不同蛋白等電點(diǎn)，蛋白可能溶解比較困難，用移液器吹打幫助溶解或者改變PH值幫助蛋白溶解，短暫離心取上清使用?；蛘哂?%SDS或者8M尿素幫助溶解蛋白沉淀后做蛋白定量。如果需要BCA蛋白定量可能需要把8M尿素稀釋到3M。

22.95℃放置5min溶解和變性蛋白，回復(fù)到室溫，最高速離心1min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳或者westernblot等試驗(yàn)。

與RNA相關(guān)的產(chǎn)品：

71118-100 Script III 1^st Strand cDNA Synthesis Kit（for PCR or qPCR）

71710-100 Script III All-in-one RT Mix with dsDNase（for qPCR）

71600-500 2x Univ ersal SYBR Green qPCR Mix(適用于所有qPCR儀)

與miRNA相關(guān)的產(chǎn)品：

71418-25 Script III miRNA 1^st StandSynthesis Kit（加尾法）

71419-500 Script III miRNA Real-Time PCR Assaykit（for qPCR，加尾法）

71613-500 Script III miRNA RT-qPCR Detection kit（71418-25+71419-500）

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