諾博萊德 總蛋白提取試劑盒（無(wú)去垢劑）

總蛋白提取試劑盒（無(wú)去垢劑）常備現(xiàn)貨

產(chǎn)品貨號(hào)：P4902

產(chǎn)品名稱：總蛋白提取試劑盒（無(wú)去垢劑）

產(chǎn)品規(guī)格：50T/100T

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

中文名稱：總蛋白提取試劑盒（無(wú)去垢劑）

規(guī)格：100T ; 50T

儲(chǔ)存條件：2-8℃，1 year

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

NobleRyder P4902 總蛋白提取試劑盒（無(wú)去垢劑）

適用樣本：動(dòng)物細(xì)胞/組織

使用前請(qǐng)注意：

1. 蛋白酶抑制劑未開(kāi)蓋使用前也可以2-8℃儲(chǔ)存。開(kāi)蓋使用后-20℃儲(chǔ)存。

2. 蛋白酶抑制劑在2-8℃低溫時(shí)是固體狀態(tài)，從冰箱取出后恢復(fù)至室溫或37℃短時(shí)間水浴，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開(kāi)蓋。

3. 試劑拆封后請(qǐng)盡快使用完！

產(chǎn)品介紹：

總蛋白提取試劑盒提供全套試劑，適用于從各種原代或傳代培養(yǎng)物細(xì)胞和各種動(dòng)物實(shí)體組織，如腦、脊髓、神經(jīng)結(jié)或纖維、脂肪、肝臟、消化道、腎臟、心臟、肌肉、血管、結(jié)締組織等動(dòng)物組織樣品中提取總蛋白。配合其他試劑時(shí)，也可以用于植物、細(xì)菌、真菌、酵母等樣品的總蛋白提取。

本試劑盒含有的du特配方能夠有效溶解細(xì)胞膜組份，包括細(xì)胞質(zhì)膜、核膜和各種細(xì)胞器膜。本試劑盒含有的蛋白酶抑制劑混合物，阻止了蛋白酶對(duì)蛋白的降解，為提取高純度的蛋白提供了保證。

本試劑盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白質(zhì)電泳、ELISA、轉(zhuǎn)錄活性分析、Gel shift 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀、酶活性測(cè)定等蛋白研究。

本試劑盒的所有組份均不含去垢劑成分，最后得到的蛋白樣品的成分對(duì)NI柱純化、分子篩、離子交換、親和純化等下游應(yīng)用沒(méi)有去垢劑影響。

本試劑盒的蛋白提取組份中不含有不可透析除去的去垢劑組份，不含SDS、Triton X-100、chaps等可能影響質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)的組份，最后得到的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過(guò)透析或者脫鹽處理后將不含有去垢劑、高濃度鹽等影響，基本可以滿足下游任意的蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。

本試劑盒提取的蛋白為具有天然蛋白構(gòu)象的活性蛋白，下游應(yīng)用范圍廣，提取液裂解細(xì)胞的能力較溫和，需要根據(jù)實(shí)際樣本情況優(yōu)化裂解時(shí)間。

本試劑盒不含有EDTA，與金屬螯合層析等下游應(yīng)用兼容。

本試劑盒提取得蛋白樣本含有高濃度得鹽成分，不可直接用于2D電泳，將最后樣品脫鹽后用于2D電泳。

本試劑盒按每個(gè)處理樣本50mg細(xì)胞/組織計(jì)（大約50μL細(xì)胞沉淀體積），如果需要處理大量的細(xì)胞/組織，將提取液按細(xì)胞體積的1：10加入細(xì)胞沉淀即可。每個(gè)50T試劑盒大約可以提取2.5g細(xì)胞/組織樣本的總蛋白。根據(jù)不同的細(xì)胞類型，100mg細(xì)胞沉淀物（107個(gè)細(xì)胞）的總蛋白質(zhì)產(chǎn)量大約為6mg左右。

適用樣本：

細(xì)胞、組織。

自備試劑和儀器：

離心機(jī)、振蕩器、渦旋混勻器、勻漿機(jī)/勻漿器、移液器、冰箱、冰盒，PBS緩沖液、蛋白定量試劑盒，離心管、吸頭、一次性手套

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1. 使用方便，從細(xì)胞、組織中提取蛋白不需經(jīng)過(guò)研磨、反復(fù)凍融、超聲破碎等前處理。

2. 將蛋白提取的時(shí)間縮短至30min-1h。

3. 含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。

4. 紫外檢測(cè)蛋白濃度時(shí)，背景干擾低。

5. 蛋白提取液含多種有效成分，可以充分釋放胞漿蛋白、核蛋白，又可結(jié)合釋出的蛋白防止沉淀。

6. 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨(dú)立的蛋白酶抑制劑AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲an酸蛋白酶、半胱an酸蛋白酶、天冬an酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

操作步驟：

一、使用注意事項(xiàng)

1. 旋帽離心管裝的試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。

2. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的所有試劑須預(yù)冷；所有器具須放-20℃冰箱預(yù)冷。整個(gè)過(guò)程須保持樣品處于低溫。

3. 蛋白酶抑制劑儲(chǔ)存期間溶液如果出現(xiàn)沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。

4. 如果試劑盒不能短時(shí)間內(nèi)用完，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。

5. 可以根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)需要加入其它蛋白酶抑制劑單品。

6. 下游實(shí)驗(yàn)如果是進(jìn)行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性檢測(cè)，提取液可以不加蛋白酶抑制劑或磷酸酶抑制劑，注意提取過(guò)程保持低溫操作，縮短離心時(shí)間。

7. Western實(shí)驗(yàn)內(nèi)參可以選用beta-actin、GAPDH、Tubulin。

8. 蛋白酶抑制劑在2-8℃時(shí)是固體狀態(tài)，從冰箱取出后恢復(fù)至室溫或37℃短時(shí)間水浴，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開(kāi)蓋。

二、細(xì)胞樣本總蛋白提取

懸浮細(xì)胞蛋白提取

1. 提取液準(zhǔn)備：

2. 每500μL冷的蛋白提取液中加入2μL蛋白酶抑制劑混合物，充分混勻后置冰上備用。

【注】：

(1) 根據(jù)需要處理樣本數(shù)量準(zhǔn)備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次性全部加入提取液。磷酸酶抑制劑可以一次加入。

(2) 加入蛋白酶抑制劑的提取液一周內(nèi)未使用wan全，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。

(3) 下游實(shí)驗(yàn)如果是進(jìn)行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性檢測(cè)，注意根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整抑制劑混合物是否加入。

(4) 以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配制好的含蛋白酶抑制劑的提取液。

3. 取5×106個(gè)細(xì)胞，在4℃，2500×g條件下離心5min，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸干，收集細(xì)胞。

【注】：

(1) 細(xì)胞數(shù)量根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況調(diào)整，每次的裂解液用量并不是一定的，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。

(2) 一般按細(xì)胞壓積的10倍左右加入裂解液即可。如果需要提高得到的蛋白樣品濃度，可以將細(xì)胞：提取液用量比例調(diào)整為1：5。

4. 用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。（加入PBS混勻，2500×g離心5min）

5. 每5×106-1×107個(gè)細(xì)胞（大約50mg細(xì)胞/50μL細(xì)胞沉淀體積）中加入500μL冷的總蛋白提取液，吹打混勻后，在4℃條件下振蕩20-30min，至細(xì)胞充分裂解，無(wú)明顯細(xì)胞沉淀。

【注】：

(1) 使用振蕩器/搖床的較低轉(zhuǎn)速，提取液能輕微晃動(dòng)即可。

(2) 沒(méi)有震蕩條件也可以不振蕩，稍微延長(zhǎng)提取液處理的時(shí)間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打均勻即可。

6. 在4℃，12000×g條件下離心15min。

7. 將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，即可得到總蛋白。

8. 將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌?shí)驗(yàn)。

【注】：

(1)   建議用BCA法進(jìn)行蛋白定量。

(2) 蛋白樣品在-80℃存放一年沒(méi)有問(wèn)題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細(xì)菌污染。

9. 將蛋白樣品透析處理或者脫鹽柱脫鹽處理后用于下游實(shí)驗(yàn)。

【注】：

(1) 蛋白樣品中含有鹽，需要脫鹽處理后用于雙向電泳。

(2) 經(jīng)透析或脫鹽離心柱處理的蛋白樣品不含有去垢劑和高濃度鹽。

貼壁細(xì)胞蛋白提取

1. 提取液準(zhǔn)備：

2. 每500μL冷的蛋白提取液中加入2μL蛋白酶抑制劑混合物，充分混勻后置冰上備用。

【注】：

(1) 根據(jù)需要處理樣本數(shù)量準(zhǔn)備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次性全部加入提取液。磷酸酶抑制劑可以一次加入。

(2) 加入蛋白酶抑制劑的提取液一周內(nèi)未使用wan全，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。

(3) 下游實(shí)驗(yàn)如果是進(jìn)行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性檢測(cè)，注意根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整抑制劑混合物是否加入。

(4) 以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配制好的含蛋白酶抑制劑的提取液。

3. 小心吸取貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液。

4. 用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干PBS。（加入PBS混勻，2500×g離心5min）

5. 加入適量冷的總蛋白提取液，振蕩15-30min，至細(xì)胞充分裂解，用細(xì)胞刮刀刮一遍，將裂解液吸入另一干凈離心管。

【注】：

(1) 推薦裂解液使用量：60mm培養(yǎng)皿250μL-500μL；100mm培養(yǎng)皿500μL-1mL；6孔板200μL -250μL/孔；24孔板100μL/孔；96孔板50μL/孔；75cm2培養(yǎng)瓶500μL-1mL。

(2) 也可用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞或者用yi酶將細(xì)胞消化下來(lái)后按懸浮細(xì)胞操作步驟進(jìn)行。

6. 在4℃，12000×g條件下離心15min。

7. 將上清吸入另一個(gè)預(yù)冷的干凈離心管，即可得到總蛋白。

8. 將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌?shí)驗(yàn)。

【注】：

(1) 建議用BCA法進(jìn)行蛋白定量。

(2) 蛋白樣品在-80℃存放一年沒(méi)有問(wèn)題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細(xì)菌污染。

9. 將蛋白樣品透析處理或者脫鹽柱脫鹽處理后用于下游實(shí)驗(yàn)。

【注】：

(1) 蛋白樣品中含有鹽，需要脫鹽處理后用于雙向電泳。

(2) 經(jīng)透析或脫鹽離心柱處理的蛋白樣品不含有去垢劑和高濃度鹽。

三、組織樣本總蛋白提取

1. 提取液準(zhǔn)備：

每500μL冷的蛋白提取液中加入2μL蛋白酶抑制劑混合物，充分混勻后置冰上備用。

【注】：

(1) 根據(jù)需要處理樣本量準(zhǔn)備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次性全部加入提取液。磷酸酶抑制劑可以一次加入。

(2) 加入蛋白酶抑制劑的提取液一周內(nèi)未使用wan全，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。

(3) 下游實(shí)驗(yàn)如果是進(jìn)行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性檢測(cè)，注意根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整抑制劑混合物是否加入。

(4) 以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配制好的含蛋白酶抑制劑的提取液。

2. 取50-100mg組織樣本，用PBS洗干凈，然后用手術(shù)jian刀盡可能剪碎，加入500μL總蛋白提取液，用組織勻漿器/勻漿機(jī)勻漿至無(wú)明顯肉眼可見(jiàn)固體。

【注】：

(1)   如果組織樣品很細(xì)小，可以剪碎后直接加入提取液振蕩15min，可以不用勻漿器。

(2)   一般按組織：提取液用量1：10（w/v）左右加入提取液即可。如果需要提高得到的蛋白樣品濃度，可以將組織：提取液用量比例調(diào)整為1：5。

(3)   也可用液氮研磨的方法，采用常規(guī)的液氮研磨方法即可。

3. 將組織勻漿吸入一預(yù)冷的干凈離心管中，在4℃條件下振蕩10-20min。

【注】：

(1) 使用振蕩器/搖床的較低轉(zhuǎn)速，提取液能輕微晃動(dòng)即可。

(2) 沒(méi)有振蕩條件也可以不振蕩，稍微延長(zhǎng)提取液的處理時(shí)間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻即可。

4. 在4℃，10000-14000×g條件下離心15min。

5. 將上清吸入另一個(gè)預(yù)冷的干凈離心管，即可得到總蛋白。

6. 將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌?shí)驗(yàn)。

【注】：

(1) 建議用BCA法進(jìn)行蛋白定量。

(2) 蛋白樣品在-80℃存放一年沒(méi)有問(wèn)題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細(xì)菌污染。

7. 將蛋白樣品透析處理或者脫鹽柱脫鹽處理后用于下游實(shí)驗(yàn)。

【注】：

(1) 蛋白樣品中含有鹽，需要脫鹽處理后用于雙向電泳。

(2) 經(jīng)透析或脫鹽離心柱處理的蛋白樣品不含有去垢劑和高濃度鹽。

常見(jiàn)問(wèn)題分析：

1. 蛋白濃度低？

處理部分組織樣本時(shí)可能沒(méi)有裂解wan全，導(dǎo)致蛋白濃度低。只要適當(dāng)增加試劑A的處理時(shí)間即可。最好在持續(xù)振蕩的條件下處理，沒(méi)有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。

2. 用什么方法定量蛋白？

建議用BCA法。不適合用Bradford法，因?yàn)樵噭〢中含有干擾Bradford法的組份，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)。如果已經(jīng)進(jìn)行過(guò)透析處理或者用脫鹽柱改換過(guò)緩沖體系，則可以用Bradford法定量。

3. 提取的蛋白具有活性嗎？

本試劑盒不含有離子型去垢劑組份，不破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，沒(méi)有對(duì)蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞，蛋白均保持其天然構(gòu)象和活性。

4. 細(xì)胞裂解速度慢？

為了充分保證提取得到的蛋白的活性，提取液采用du特的保護(hù)蛋白的配方，裂解能力溫和，下游應(yīng)用范圍廣。適當(dāng)延長(zhǎng)裂解的時(shí)間即可。

5. 提取時(shí)出現(xiàn)膠狀沉淀？

蛋白提取液處理產(chǎn)物中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)少量透明膠狀物，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物。不檢測(cè)和基因組DNA結(jié)合特別緊密的特定蛋白的情況下，可以直接離心取上清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)即可；如果需要檢測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過(guò)超聲處理，300w/10s間隔10s，超聲3min，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)一些常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-kappaB、p53等時(shí)，不必進(jìn)行超聲處理。

注意事項(xiàng)：

1. 正式實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)選取幾個(gè)樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，取得優(yōu)良實(shí)驗(yàn)效果。

2. 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋和管內(nèi)壁上的液體離心至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)試劑損失。

3. 禁止與其他品牌的試劑混用，否則會(huì)影響使用效果。

4. 樣品或試劑被細(xì)菌或真菌污染或試劑交叉污染可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。

5. 最好使用一次性吸頭、管、瓶或玻璃器皿，可重復(fù)使用的玻璃器皿必須在使用前清洗并che底清除殘留清潔劑。

6. 實(shí)驗(yàn)完成后所有樣品及接觸過(guò)的器皿應(yīng)按照規(guī)定程序處理。

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