實驗條件的選擇

在 ELISA 中，選擇各種實驗條件很重要，包括：

(1)固相載體的選擇：許多物質都可以用作固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、纖維素等?？梢允强装?、試管、珠子等形式，常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。無論是何種載體，使用前都可以進行篩選：包被等量的抗原，在相同的實驗條件下進行反應。

(2)包被抗體(或抗原)的選擇：當抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時，要求純度好，一般要求pH在9.0～9.6之間在吸附過程中。吸附溫度、時間和蛋白質的量也有一定的影響，一般4℃18～24小時。蛋白質包被的最佳濃度需要滴定：即在包被不同的蛋白質濃度（0.1、1.0和10μg/ml等）后，在其他測試條件相同的情況下觀察陽性樣品的OD值.選擇 OD 值最高、蛋白質含量最少的濃度。對于大多數蛋白質，通常為 1-10 μg/ml。

（3）酶標抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法滴定初始效價（見酶標抗體部分）。然后固定其他條件或采用“方陣法"（包被材料、待測樣品對照品和酶標抗體處于不同稀釋度）在正式實驗系統(tǒng)中準確滴定工作濃度。

(4)酶底物和氫供體的選擇：氫供體的選擇要求便宜、安全、顯色反應明顯，但本身是無色的。一些供氫體（如OPD等）具有潛在的致癌作用，應予以保護。有條件的應選用非致癌、高靈敏度的供氫體，如TMB、ABTS等，都是比較滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應加入強酸或強堿停止反應。通常底物作用時間為10-30分鐘。底物溶液必須新鮮配制，特別是在使用前應立即加入 H2O2。

安全性

1． 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。

2． 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

4． 試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。

5． 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。

6． 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。

7． 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

8． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

9． 洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。

10． 底物A應揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。

11． 加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。

12． 按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

自備材料

1． 蒸餾水。

2． 加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

3． 振蕩器及磁力攪拌器等。

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