原代細(xì)胞具有貼壁特殊性，因此在消化后轉(zhuǎn)移至其他實(shí)驗(yàn)器皿（如玻璃爬片、培養(yǎng)板、共聚焦培養(yǎng)皿等）時(shí)，常出現(xiàn)貼壁不牢的情況，因此我們需要對(duì)實(shí)驗(yàn)器皿進(jìn)行包被處理，以增強(qiáng)細(xì)胞的貼壁性。
本期細(xì)胞學(xué)堂將為您詳述原代細(xì)胞培養(yǎng)中的包被操作步驟及注意事項(xiàng)，讓您的實(shí)驗(yàn)順暢無阻！
為了適應(yīng)不同實(shí)驗(yàn)需求，需要對(duì)培養(yǎng)器皿用不同的物質(zhì)包被后使用，包被條件常選用膠原蛋白Ⅰ（12μg/mL）、多聚賴氨酸PLL（0.1mg/mL）和明膠（0.1%）三種，依據(jù)細(xì)胞種類而定。
NO、1
膠原蛋白Ⅰ
膠原蛋白Ⅰ是最常見的膠原蛋白，能促進(jìn)細(xì)胞的貼壁和增殖，常用于上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌細(xì)胞等原代細(xì)胞的培養(yǎng)；
NO.2
多聚賴氨酸PLL
多聚賴氨酸是一種合成化合物，是帶正電荷的氨基酸，通過改變培育基質(zhì)外表的電極來促進(jìn)細(xì)胞貼壁，其包被的培養(yǎng)板適用于神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的培養(yǎng)；
NO.3
明膠
明膠來自于膠原的高分子量水溶蛋白混合物，0.1％的明膠溶液常用于包被培養(yǎng)器皿以促進(jìn)細(xì)胞貼壁。明膠包被板常用于培養(yǎng)正?；蜣D(zhuǎn)染細(xì)胞如血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、胰島細(xì)胞等。
1
準(zhǔn)備器皿
取出無菌培養(yǎng)器皿，如T25培養(yǎng)瓶（以下以T25瓶為例）；
2
加包被試劑
取出包被試劑，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用移液器吸取1-2mL，加入T25瓶內(nèi)，輕輕晃動(dòng)瓶身，確保底部全部覆蓋液體（注：使用的包被試劑為膠原蛋白Ⅰ或明膠時(shí)，1瓶可一次性加入5mL，同時(shí)包被5瓶，用5mL潤洗每瓶瓶底部后，每瓶均分1mL進(jìn)行后續(xù)包被操作)；
3
放入培養(yǎng)箱
將培養(yǎng)瓶蓋好，放入37℃培養(yǎng)箱。PLL包被需要靜置30-60min以上，膠原蛋白Ⅰ包被和明膠包被需要靜置1-2h以上；
4
吸取包被試劑
取出培養(yǎng)瓶，吸出多余包被試劑（可留取下次使用，建議PLL試劑重復(fù)使用不超過2-3次，膠原蛋白Ⅰ和明膠重復(fù)使用不超過1次，多次使用會(huì)增加污染概率，減弱包被效果）；
5
靜置
將培養(yǎng)瓶蓋好，放入37℃培養(yǎng)箱（也可放4℃冰箱，保持無菌即可），靜置4-24h以上，確保培養(yǎng)瓶底部干燥、無液體。包被完畢，培養(yǎng)瓶一般可存放3-7天（常溫或4℃），建議3天內(nèi)使用，存放過久，包被效果可能失效；
6
清洗
取出包被好的培養(yǎng)瓶，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用PBS或培養(yǎng)基清洗。PLL包被的培養(yǎng)瓶需清洗2-3次，膠原蛋白Ⅰ和明膠包被培養(yǎng)瓶則清洗1-2次即可；
7
包被完成
正常接種使用培養(yǎng)瓶。
01
包被試劑的保存：無菌多聚賴氨酸PLL（0.1mg/mL）需要4℃下保存，可保存三個(gè)月；無菌膠原蛋白Ⅰ（12μg/mL）和無菌明膠（0.1%）需要在4℃下保存，1-2周內(nèi)使用，蛋白制品放置過久易失效；
02
選擇包被液用量依據(jù)不同培養(yǎng)器皿而定，一般確保培養(yǎng)器皿底部完-全覆蓋為準(zhǔn)（并且確保包被時(shí)間內(nèi)不干）；
培養(yǎng)器皿 | 用量推薦（僅供參考） |
12孔板/孔 | 0.5mL |
6孔板/孔 | 0.8mL |
6cm培養(yǎng)皿/皿 | 1-1.5mL |
10cm培養(yǎng)皿/皿 | 3mL |
T25瓶/瓶 | 1-1.5mL |
T75瓶/瓶 | 3-4mL |
03
PLL有輕微毒性，膠原蛋白Ⅰ、明膠配置溶劑部分有少量毒性，所以包被后的培養(yǎng)器皿，使用前必須用PBS或培養(yǎng)基清洗1-3次；
04
細(xì)胞爬片等玻璃制品因材質(zhì)問題，本身吸附能力弱，一般必須包被；
05
包被分為包被時(shí)間和干燥時(shí)間，包被時(shí)間是包被液吸附作用時(shí)間，一般按推薦時(shí)間即可。干燥時(shí)間是包被后培養(yǎng)器皿晾干時(shí)間，是為了確保包被液晾干，達(dá)到更好的粘性吸附效果；
06
以上所有操作均以無菌試劑、耗材，無菌環(huán)境內(nèi)操作為前提。
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