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使用 VisiSens™ A1 進(jìn)行氧成像可以對(duì)微生物培養(yǎng)物內(nèi)的耗氧量進(jìn)行二維映射。緊湊的測(cè)量系統(tǒng)可用于直接監(jiān)測(cè)培養(yǎng)箱內(nèi)的代謝活動(dòng)。例如，研究了瓊脂上的大腸桿菌培養(yǎng)物，以證明成像設(shè)備能夠可視化整個(gè)培養(yǎng)表面的氧梯度。結(jié)果清楚地顯示了氧氣梯度如何圍繞單一培養(yǎng)物演變，以及氧氣水平如何隨著時(shí)間的推移隨著與其他培養(yǎng)物的距離而降低。

圖 2：多孔板中的傳感器集成：傳感器箔片粘在孔的底部（A）；使用 VisiSens™ 檢測(cè)器單元 (B) 讀取的非侵入式傳感器的圖示。

微生物和細(xì)胞/組織培養(yǎng)在生物和醫(yī)學(xué)研究或生物技術(shù)中發(fā)揮著重要作用并且是重要的工具。了解菌落內(nèi)細(xì)胞和結(jié)構(gòu)的局部代謝活動(dòng)可能有助于理解和控制復(fù)雜的生長(zhǎng)過程。栽培控制中的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)是氧氣。氧氣消耗或生產(chǎn)可以提供有關(guān)培養(yǎng)物代謝狀態(tài)的有價(jià)值的信息。因此，精確的氧氣測(cè)量系統(tǒng)是必要的。然而，傳統(tǒng)的測(cè)量技術(shù)，例如電極，僅允許單點(diǎn)測(cè)量，缺乏關(guān)于樣品中氧分布的空間信息。即使使用氧氣微傳感器進(jìn)行橫斷面測(cè)量也不能*克服這一限制。VisiSens™ A1 系統(tǒng)將平面熒光傳感器箔與數(shù)碼相機(jī)技術(shù)相結(jié)合，現(xiàn)在可以對(duì)樣品表面的氧氣分布進(jìn)行二維評(píng)估。熒光傳感器箔片無毒，在測(cè)量過程中不消耗氧氣。整個(gè)區(qū)域的信息可以以 µm 分辨率記錄，以延長(zhǎng)測(cè)量周期。使用緊湊型熒光顯微鏡非接觸式讀取傳感器箔片。它可以很容易地安裝在培養(yǎng)箱內(nèi)，并通過 PC 或筆記本電腦從外部進(jìn)行控制（圖 1）。能夠可視化和評(píng)估由于代謝和擴(kuò)散過程引起的氧分壓變化，使 VisiSens™ 成為細(xì)胞和組織培養(yǎng)監(jiān)測(cè)的理想工具。我們測(cè)試了這種測(cè)量技術(shù)，調(diào)查不同植物組織中的氧氣分布，并在非植物應(yīng)用中進(jìn)行了嘗試。在此處描述的實(shí)驗(yàn)中大腸桿菌 被用作模型微生物。培養(yǎng)箱內(nèi)的 VisiSens™ A1 系統(tǒng)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物，并觀察單個(gè)菌落的耗氧量。

材料與方法

在實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)，通過記錄亞硫酸鈉溶液（0% 空氣飽和度）和空氣飽和蒸餾水（100%空氣飽和度）。大腸桿菌菌落在瓊脂板上生長(zhǎng)，傳感器箔直接放在培養(yǎng)物上。VisiSens™ 檢測(cè)器單元（DU01，PreSens）安裝在培養(yǎng)箱內(nèi)，并通過筆記本電腦從外部進(jìn)行控制。使用 VisiSens™ AnalytiCal 1 軟件實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)器單元控制和后續(xù)圖像分析。將培養(yǎng)物放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20分鐘后立即開始圖像記錄；圖像以 30 秒的間隔拍攝。

成像大腸桿菌菌落

使用氧傳感器進(jìn)行短期孵育（5-20 分鐘）會(huì)產(chǎn)生清晰的氧分布圖像，其中單個(gè)菌落可通過其耗氧量識(shí)別（圖 3）。菌落位置的氧氣濃度在 20 分鐘內(nèi)迅速下降（圖 4 + 5）。氧氣圖像進(jìn)一步揭示了氧氣減少如何取決于與其他菌落的距離（圖 4）。在擴(kuò)散和多個(gè)相鄰大腸桿菌菌落耗氧的驅(qū)動(dòng)下，培養(yǎng)基內(nèi)的氧含量也會(huì)隨著時(shí)間而變化（圖 6）。

圖 3：在瓊脂上生長(zhǎng)的大腸桿菌菌落的氧氣圖像；黃色表示高氧，藍(lán)色表示低氧濃度。

圖 4：短期孵化期間大腸桿菌菌落的時(shí)間序列記錄。可以清楚地確定氧氣分布隨時(shí)間的變化和消耗。黃色表示高氧，藍(lán)色表示低氧濃度。

圖 5：由耗氧量直接驅(qū)動(dòng)的大腸桿菌菌落部位的氧氣發(fā)展。使用 VisiSens™ AnalytiCal 1 軟件分析的感興趣區(qū)域如左圖所示。

圖 6：由擴(kuò)散和幾個(gè)相鄰大腸桿菌菌落的氧氣消耗驅(qū)動(dòng)的培養(yǎng)基內(nèi)的氧氣發(fā)展。使用 VisiSens™ AnalytiCal 1 軟件分析的感興趣區(qū)域如左圖所示。

結(jié)論

VisiSens™ 能夠可視化多孔板或培養(yǎng)皿中的不同位點(diǎn)。應(yīng)用于微生物培養(yǎng)，可以區(qū)分單個(gè)菌落的耗氧量。通過可視化樣品中的氧氣分布及其隨時(shí)間的變化，可以獲得有價(jià)值的信息，這些信息可用于監(jiān)測(cè)代謝狀態(tài)或調(diào)節(jié)氧氣供應(yīng)，以更好地控制細(xì)胞或組織培養(yǎng)中的某些過程。VisiSens™ 的使用促進(jìn)了呼吸動(dòng)力學(xué)的研究，并將有助于更好地理解許多應(yīng)用領(lǐng)域，例如酵母中呼吸表型的篩選。