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細(xì)數(shù)流式細(xì)胞儀驗(yàn)證的基本流程

1．流式細(xì)胞儀介紹

流式細(xì)胞儀(Flowcytometry)是對(duì)于處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒同時(shí)利用檢測器進(jìn)行多參數(shù)、快速的自動(dòng)分析和分選的裝置。它可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細(xì)胞的一系列重要的生物物理、生物化學(xué)方面的特征參量，并可以根據(jù)預(yù)選的參量范圍的細(xì)胞亞群從中分選出來。 但流式細(xì)胞儀的細(xì)節(jié)分辨率為零，即它只能測量一種細(xì)胞的總核酸量，總蛋白量等指標(biāo)，而不能鑒別和測出某一特定部位的核酸或蛋白的具體數(shù)目。流式細(xì)胞儀主要由液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、分析系統(tǒng)四部分組成。目前已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、基礎(chǔ)科學(xué)研究、細(xì)胞遺傳學(xué)、生物化學(xué)等研究的各個(gè)領(lǐng)域。

2．流式細(xì)胞儀的原理

流式細(xì)胞儀的工作原理為：將經(jīng)特異性熒光染料染色后的待測細(xì)胞放入樣品管中，細(xì)胞在氣體的壓力下進(jìn)入充滿鞘液的流動(dòng)室，然后鞘液和樣品流在噴嘴附近組成一個(gè)圓柱流束，與水平方向的激光束垂直相交，染色的細(xì)胞受激光照射后發(fā)出熒光或產(chǎn)生散射光，這些信號(hào)分別被光電倍增管熒光檢測器和光電二極管散射光檢測器接收，轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)后，經(jīng)過計(jì)算機(jī)儲(chǔ)存、計(jì)算、分析這些數(shù)字化信息，就可得到細(xì)胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性質(zhì)等物理和生化指標(biāo)。

3．相關(guān)術(shù)語

設(shè)門：劃定某一區(qū)域的細(xì)胞群體，對(duì)其單獨(dú)加以分析或分選。

調(diào)補(bǔ)償：若兩種以上的熒光素的發(fā)射光譜之間存在重疊，則需要調(diào)補(bǔ)償。

MFI值：即為平均熒光強(qiáng)度。

4．為什么流式細(xì)胞儀要做驗(yàn)證呢？

流式細(xì)胞儀是對(duì)細(xì)胞或生物顆粒物理、化學(xué)等相關(guān)參數(shù)的自動(dòng)分析和分選的裝置，對(duì)流式細(xì)胞儀進(jìn)行驗(yàn)證就是保證分析檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，所以必須對(duì)所用到的組成系統(tǒng)各部分進(jìn)行驗(yàn)證，以證明該系統(tǒng)符合檢測的目的和要求，這就是儀器驗(yàn)證。本質(zhì)上講，儀器驗(yàn)證就是根據(jù)檢測物質(zhì)的要求，預(yù)先對(duì)儀器設(shè)置一定的參數(shù)范圍及合適的檢測器，并通過設(shè)計(jì)合理的試驗(yàn)來驗(yàn)證該儀器是否符合檢測項(xiàng)目的要求。這些驗(yàn)證項(xiàng)目如分辨力、線性相關(guān)系數(shù)、重復(fù)性、示值誤差等某一個(gè)產(chǎn)生誤差，其他的都會(huì)有一定的偏移，致使結(jié)果改變。儀器驗(yàn)證就是保證整個(gè)試驗(yàn)是否能成功的先決條件，只有經(jīng)過驗(yàn)證的儀器，確保該儀器各部分都在良好的情況下才能用于細(xì)胞相關(guān)參數(shù)的分析、分選，使檢測結(jié)果得到保證，使誤差降低到最小。

5．流式細(xì)胞儀的驗(yàn)證項(xiàng)目

（1）  安裝確認(rèn)

a.  文件確認(rèn)

b.  附件確認(rèn)

c.  安裝環(huán)境確認(rèn)

d. 安裝情況確認(rèn)

（2）  運(yùn)行功能確認(rèn)

a.  運(yùn)行功能確認(rèn)

b.  軟件控制功能測試

（3） 性能確認(rèn)

a.  分辨力測試

b.   線性相關(guān)系數(shù)測試

c.  檢出限測試

d.  漂移測試

e.  重復(fù)性測試

f.  示值誤差測試

6．流式細(xì)胞儀的操作步驟

(1)  檢測鞘液桶和廢液桶的狀態(tài)是否滿足本次使用，蓋緊黑蓋；

(2)  檢測穩(wěn)壓電源，打開電源，對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)熱5-10分鐘；

(3)  打開氣體閾，調(diào)節(jié)壓力，獲得適宜的液流速度，應(yīng)排除管路中氣泡；開啟光源冷卻系統(tǒng)；

(4)  在樣品管中加入去離子水，沖洗液流的噴嘴系統(tǒng)；

(5)  利用校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣品，調(diào)整儀器，使在激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調(diào)定的基礎(chǔ)上，0和90散射的熒光強(qiáng)度*，并要求變異系數(shù)為最?。?/span>

(6)  選定流速、測量細(xì)胞數(shù)、測量參數(shù)等，在同樣的工作條件下測量樣品和對(duì)照樣品；同時(shí)選擇計(jì)算機(jī)屏上數(shù)據(jù)的顯示方式，從而能直觀掌握測量進(jìn)程；

(7)  樣品測量完畢后，再用去離子水沖洗液流系統(tǒng)；

(8)  因?yàn)閷?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)已存入計(jì)算機(jī)硬盤（有的機(jī)器還備有光盤系統(tǒng)，存貯量更大），因此可關(guān)閉氣體、測量裝置，而單獨(dú)使用計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；

(9)  最后將所需結(jié)果打印出來，操作完畢，關(guān)機(jī)。

7．注意事項(xiàng)

a.   光電倍增管要求穩(wěn)定的工作條件，所有需放置在避光的環(huán)境下；另外還要注意磁屏蔽；

b.   光源不得在短時(shí)間內(nèi)（一般要1h左右）關(guān)上又打開；使用光源必須預(yù)熱并注意冷卻系統(tǒng)工作是否正常；

c.   液流系統(tǒng)必需隨時(shí)保持液流暢通，避免氣泡堵塞；

d.   鞘流液使用前要經(jīng)過過濾、消毒，必須符合使用要求；

e.   不同的檢測對(duì)象選用對(duì)應(yīng)的濾片系統(tǒng)、放大器的類型等；

f.   特別注意的是每次檢測都需要空白對(duì)照組，做對(duì)照試驗(yàn)；

g.   調(diào)節(jié)電壓時(shí)，如果檢測的目標(biāo)細(xì)胞體積較小，可以適當(dāng)提高電壓值。

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