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原代細(xì)胞分離與培養(yǎng)科研實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)介紹
閱讀：59 發(fā)布時(shí)間：2024-9-19應(yīng)用簡(jiǎn)介
凡是來(lái)源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來(lái)的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱(chēng)之為原代細(xì)胞。通過(guò)原代分離獲得的細(xì)胞具有與體內(nèi)細(xì)胞相似的生物學(xué)特征，是研究生物體相關(guān)生命活動(dòng)的理想材料。
原理介紹
原代細(xì)胞的分離是將人/小鼠等特異模式動(dòng)物的細(xì)胞從機(jī)體中取出，經(jīng)胰酶、螯合劑（常用EDTA）處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖的過(guò)程。原代培養(yǎng)是指直接從機(jī)體取下細(xì)胞、組織和器官后立即進(jìn)行培養(yǎng)。因此，較為嚴(yán)格地說(shuō)是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時(shí)的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì)，如果是正常細(xì)胞，仍然保留二倍體數(shù)。但實(shí)際上，通常把第一代至第十代以?xún)?nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱(chēng)為原代細(xì)胞培養(yǎng)。zui常用的原代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細(xì)胞培養(yǎng)。
實(shí)驗(yàn)方法
一、懸浮細(xì)胞的分離方法
組織材料若來(lái)自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，可采用低速離心。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。
二、實(shí)體組織材料的分離方法
對(duì)于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。其中，機(jī)械分散法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速，但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差，適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng)。
三、小鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)
流程圖：
1、原代培養(yǎng)材料的選擇，盡量選取繁殖能力較強(qiáng)的組織，如胚胎、幼小的生物體或者腫瘤組織等。
2、要注意無(wú)菌操作。其操作要求應(yīng)高于外科手術(shù)、
3、整個(gè)取材操作要迅速，尤其孕鼠浸泡乙醇時(shí)間1min左右，不能過(guò)長(zhǎng)，以確保胚胎細(xì)胞活性。
4、運(yùn)用消化法時(shí)胰酶溫度應(yīng)低于37℃，濃度只需平時(shí)消化細(xì)胞濃度的一半。因?yàn)榇诉^(guò)程不像消化培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)的1~10min，而是至少20min，先消化下來(lái)的細(xì)胞在此胰酶消化液中繼續(xù)消化了10min以上。所以胰酶不能作用過(guò)強(qiáng)，否則這些細(xì)胞易被損傷而不易生存。
5、如使用組織塊法，則應(yīng)待組織塊略干燥，能黏附于瓶壁時(shí)再使之與培養(yǎng)液接觸，匆使組織塊漂浮起來(lái)。如果組織塊沒(méi)有黏壁，則細(xì)胞不易生長(zhǎng)，即使生長(zhǎng)也因沒(méi)有貼在瓶壁上，從而因不能觀察到而無(wú)法收集到生長(zhǎng)的細(xì)胞。
6、原代培養(yǎng)操作時(shí)，也可以使用未添加血清的DMEM或PBS洗滌子宮、胚胎或組織塊等。
7、本實(shí)驗(yàn)也可以使用新生乳鼠做培養(yǎng)材料。此時(shí)要將乳鼠浸入75%乙醇2~3min使皮膚充分消毒，由于乳鼠原代培養(yǎng)污染概率更高，故應(yīng)小心操作，避免污染細(xì)菌。乳鼠原代培養(yǎng)細(xì)胞的存活率不及胚胎細(xì)胞培養(yǎng)的成功率。