Western一抗二抗通用稀釋液公司正在出售的產(chǎn)品：小鼠精母細胞　20號染色體開放閱讀框50封閉多肽 　茹拉巴德古柏線蟲PCR檢測試劑盒　大鼠髓過氧化物特異性抗中性粒細胞胞質(zhì)抗體IgG(MPO-ANCA IgG)ELISA Kit　水樣中六價鉻離子（Cr6+）濃度活性比色法檢測試劑盒　白蟻菌　谷肽硫轉(zhuǎn)移C段結(jié)構(gòu)域抗體

商品屬性：

生產(chǎn)的 Western 一抗二抗通用稀釋液用于做 Western blot 實驗時一抗或者二抗的稀釋。用本稀釋液稀釋的一抗或者二抗使用后，可放在 4℃或者-20℃保存，并且可以反復多次使用，節(jié)約您寶貴的抗體。按照每個一抗稀釋10ml 計算，該 Western 一抗稀釋液可以稀釋 10 個或 10 次Western Blot 雜交實驗。該制品中不含有抑制熒光顯色或HRP 顯色的成分。應用：Western blot 實驗時一抗或者二抗的稀釋
儲存：-20℃ 可保存 3 年。開始使用后請于 4℃保存，有效期為 1 年。
使用方法：
1. 進行一抗孵育雜交參考所用的一抗說明書，以及樣品中目的蛋白的含量，使用本抗體稀釋液按照適當比例稀釋一抗，如 1:1000、1:500 等，一抗稀釋后即可直接用于 Western blot 實驗（室溫孵育雜交1h 或 4℃雜交過夜）。實驗結(jié)束后，可以回收稀釋的一抗，4℃或-20℃ 保存，以用于下次的 Western blot 實驗。
2. 進行二抗孵育雜交進行完一抗孵育后，TSBT 溶液洗滌膜 1~2 次，同樣參考二抗說明書，使用本抗體稀釋液，進行二抗的稀釋，并進行二抗的孵育雜交（通常二抗雜交時間為室溫 30min 即可）。雜交完畢后 TBST 洗滌膜 3~4 次，并進行下游顯色。PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內(nèi)DNA的復制。在生物體內(nèi)DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列，實現(xiàn)對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環(huán)境；反應過程同生物體內(nèi)一樣，DNA雙鏈打開，引物結(jié)合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復重復此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結(jié)束反應， 減少非特異性產(chǎn)物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產(chǎn)物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結(jié)合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結(jié)合，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現(xiàn)PCR反應的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質(zhì)的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或?qū)⒛０暹M行稀釋。

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