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高通量色譜柱對甘草提取物進行高分離度反相 HPLC 分析
閱讀：555 發(fā)布時間：2023-5-18前言藥用甘草取自生長在歐洲、中東和西亞的高約 4、5 英尺的灌木植物光果甘草（Glycyrrhiza glabra）的根部。已知該植物的根含有約 4%的甘草甜素，即甘草酸的鉀鹽或鈣鹽。甘草酸為帶兩分子葡萄糖醛酸的五環(huán)三萜羧酸（18-?-甘草次酸）的糖苷（圖 1）。甘草甜素比蔗糖甜 50 倍，但已知大劑量時有毒。水解后糖苷失去甜味，轉(zhuǎn)化為甘草次酸苷元和兩分子葡萄糖醛酸。使用長的 1.8 µm 快速分離高通量色譜柱對甘草提取物進行高分離度反相 HPLC 分析應用報告任何品種甘草的萃取物都包含 100 多種化合物。其中的幾種被用作糖果中的甜味劑、止咳糖漿中的調(diào)味劑，以及在藥物中用來掩蓋苦味，而中草藥（TCM）主要利用其治療效用。甘草的治療效用早在幾個世紀前就被中國、印度、埃及、希臘和羅馬所知。其用途包括止咳劑、瀉藥，還可用于治療胃潰瘍、阿狄森氏病和肝病。近來，已證明甘草甜素有對抗 DNA 和 RNA病毒（流感病毒 A 和 B、HIV、VZV 和 B 型和 C 型肝炎病毒）的抗病毒活性[1]。甘草也用于外用化妝品。
甘草種類不同、采收時間不同、提取方法不同都會使目標化合物的豐度發(fā)生很大變化。因此，需要能夠檢測甘草中活性成分的分析方法。已有研究表明，梯度洗脫反相 HPLC 法可以作為分離甘草中某些重要化合物的有效方法[2]。本應用報告對經(jīng)典HPLC 方法和使用新的快速分離高通量(RRHT)色譜柱的 HPLC方法進行了比較。我們用這些 HPLC 技術(shù)研究了兩種市售甘草根提取物的差異。
實驗本研究中所用的兩種反相（RP）柱：• 常規(guī)的 ZORBAX StableBond (SB)-C18, 4.6 mm x 250 mm，5 µm• ZORBAX SB-C18 RRHT, 4.6 mm x 150 mm, 1.8 µmRRHT 柱填料粒徑較小，因此用較短的柱子即可得到與常規(guī)長柱相同的分離度，而且可以加快分離速度。
結(jié)果HPLC 條件儀器： Agilent 1200 系列高分離度快速液相色譜系統(tǒng)檢測器： 多波長檢測器 (MWD)，254 nm/100 BW，450 nm 參比波長流動相： A = 1% 醋酸水溶液B = 1% 醋酸乙腈溶液ZORBAX SB-C18 柱的梯度條件：常規(guī)： 4.6 mm x 250 mm，5 µm5% 到 100% B 50 分鐘RRHT: 4.6 mm x 150 mm，1.8 µm5% 到 100% B 30 分鐘流速： 1.0 mL/min溫度： 室溫標準樣品： 購自 Sigma Aldrich• (G) 0.1 mg 甘草酸銨鹽，純度~75%，溶于 0.5 mL 流動相 B，并加 0.5 mL 流動相 A 至 1.0 mL• (GA) 0.1 mg 18-?-甘草次酸，純度 97%，溶于 0.5 mL 流動相 B，并加 0.5 mL 流動相 A 至 1.0 mL樣品：• 甘草提取物 A (HERB FARM)• 甘草提取物 B (紐瓦克天然食品)兩種提取物都經(jīng)渦旋混合，并于進樣前過濾 (0.2 微米)。進樣量： 5 µL 提取物
一般甘草提取物中最重要的化合物是 G，其次是其水解產(chǎn)物GA。這些物質(zhì)都有商品出售。雖然甘草中也有其它組分被鑒定出來，并有商品出售，但都相當昂貴。因為我們的主要目的是說明使用高分離度 HPLC 短柱的*性，所以在開始建立方法時我們只用了兩種標準品（G 和 GA）。圖 2a 為 G 和 GA 在常規(guī)柱（ZORBAX SB-C18，4.6 mm x 250 mm，5 µm）上梯度分離的結(jié)果。待檢測的甘草提取物成分非常復雜，所以用等度條件并不能分離所有組分。因帶糖基的 G 極性更大，先被洗脫，而GA 遠在其后被洗脫。采用該梯度，GA 在 42 分鐘出峰。切換到較短的 ZORBAX SB-C18 RRHT 柱（4.6 x 150 mm，1.8 µm）上后，分離效果相同，如圖 2b 所示，但分離時間僅為 25 分鐘，節(jié)省了 40% 左右的時間。
圖 3 和圖 4 顯示了這兩種色譜柱對實際甘草提取物的分離情況。按實驗部分所述，對過濾后的提取物進樣，得到復雜的色譜圖。圖 3a 顯示用粒徑 5 µm、長 250 mm 的色譜柱得到的復雜色譜圖。截圖顯示提取物中有少量 GA 存在。GA 是 G 的水解產(chǎn)物，因此其在甘草提取物中的濃度應低得多，除非為了增加水解產(chǎn)物的濃度將提取物進行處理。從峰面積計算可知，提取物 A中 GA 濃度不到 G 的 0.5%。雖然實際的峰數(shù)沒有計算，但 5 µm 柱的計算峰容量（3）應為290 (分離度= 1.0)。用粒徑 1.8 µm、長 150 mm 的色譜柱分離同樣的提取物 A，可以看到色譜圖分得更好（即分離度更高）（圖 3b）。這一高柱效色譜柱的計算峰容量為 442，比用 5 µm 長的色譜柱高 50%。因此，在快速分離短柱上，更容易測定微小組分。計算得到 1.8 µm 柱單位時間的峰數(shù)（分離度= 1.0）為17.7 個峰/分鐘，而 5 µm 柱僅為 7.1 個峰/分鐘。圖 4a 和 4b 顯示用提取物 B 進行的類似分離。該提取物比提取物 A 更為復雜，將圖 3b 的高分離度色譜圖與 4b 進行對比。同樣，計算的 1.8 µm 每分鐘峰數(shù)值遠遠高于 5 µm 柱(分別為17 和 7.5)。根據(jù)峰面積計算可知，提取物 B 中 GA 約為 G 的1%。
結(jié)論尚未對甘草提取物中的組分進行定量分析。從我們的研究中可知，1.8 µm 柱的分離度和通量遠遠超過了 5.0 µm 常規(guī)柱。當遇到天然產(chǎn)物的更復雜樣品時，分析人員需要更精細的組分分析，高分離度、小粒徑色譜柱的使用將會越來越多。研究甘草、其它天然產(chǎn)物和中草藥時，都需要進行梯度分離和高靈敏度檢測。