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白毛茛中生物堿的提取和HPLC 分析
閱讀：452 發(fā)布時間：2023-5-15摘要本文建立了對白毛茛根粉末中生物堿進行室溫萃取，并用Zorbax 快速分離 Eclipse XDB-C18 柱進行 HPLC 分析的方法，用該法準確測定了白毛茛中包括小糪堿和白毛茛堿在內(nèi)的主要生物堿。也可以用這一萃取和 HPLC 分析方法測定其它生物堿，包括氫化小糪堿、白毛茛分堿和巴馬亭。還可以應用于其它含小糪堿的植物根的分析。Eclipse XDB-C18 快速分離柱采用等度分離，所有組分在 15 分鐘內(nèi)實現(xiàn)了高分離度分離。
前言白毛茛(goldenseal)，學名 Hydrastis canadensis L.，是最老的草藥植物之一，其作為天然藥物正在受到人們的關注。白毛茛中存在的兩種主要生物堿——小糪堿和白毛茛堿——被認為是其中的活性成分。氫化小糪堿、白毛茛分堿、5-羥基小糪堿和 canadaline 都是含量很小的生物堿。巴馬亭與小糪堿密切相關，但在白毛茛中沒有檢測到，而在另一種含小糪堿的植物——黃連(Coptis)中卻檢測到了巴馬亭[1]。白毛茛已被用作消炎藥和抗生素。也用作治療鼻充血、感冒、流感和多種腸道紊亂。該植物的整個根部都用來入藥，目前市售的劑型有散裝（干燥或粉末化的白毛茛根）、片劑、膠囊和酊劑。由于野生白毛茛已經(jīng)被過度采集，現(xiàn)在大量的白毛茛由人工種植，以補充草藥來源。作為草藥補充物銷售的白毛茛質(zhì)量參差不齊，其中的活性生物堿含量差異很大。因此，迫切需要一種簡單的方法進行生物堿的萃取和分析，以評價產(chǎn)品的質(zhì)量。圖 1 顯示了白毛茛中生物堿的化學結構。
實驗部分萃取步驟Betz 和 Anderson[1]以及 Burney[2]曾報導了室溫條件下從白毛茛中萃取生物堿的方法。按照此方法進行萃取，然后采用HPLC液相色譜 對生物堿提取物進行精確定量分析。純白毛茛根粉末的優(yōu)化室溫萃取條件總結如下：1. 稱取約 0.5 g 白毛茛根粉末2. 加入 100 mL 乙腈:水:H3PO4 (70:30:0.1，v/v/v)，混勻3. 超聲處理 5 分鐘，振搖（手腕抖動）10 分鐘，離心 5 分鐘4. 5 倍稀釋萃取物5. 稀釋后的萃取物直接進行 HPLC 分析
HPLC 分析白毛茛中生物堿的 HPLC 分析，要求能夠分離主要的生物堿。此外，還需要能夠分離巴馬亭，因為它存在于其它含有小糪堿的植物中。我們開發(fā)了一種能夠分離所有這些組分的 HPLC 方法。采用 Zorbax Eclipse XDB-C18 色譜柱、醋酸銨緩沖液和乙腈混合流動相，可得到最佳的分離度和峰形。圖 2 顯示了分離結果，并列出了所采用的全部優(yōu)化分離條件。為獲得一致的保留時間，溫度控制在 30°C[3]。
方法驗證采用本 HPLC 方法可對室溫萃取方法進行驗證。本方法研究了線性、精度和生物堿的回收率。表 1 列出了這些結果。方法的精度良好，不同生物堿的回收率范圍在 92%-102%，適用于定量分析。線性很好（圖 3），靈敏度良好。通過標樣數(shù)據(jù)計算出的小檗堿的檢測限(LOD)為 0.50 mg/mL，定量限(LOQ)為1.65 mg/mL。因此可以對低水平含量的小檗堿進行精確定量，適用于檢測不同來源白毛茛產(chǎn)品的質(zhì)量。
結果白毛茛的測定采用室溫萃取方法和 HPLC 分析方法測定來自 3 個不同供貨商的 6 批白毛莨根粉末樣品中生物堿的含量，結果列于表 2。這些結果說明來自不同供貨商的樣品的質(zhì)量是不同的，也說明了需要一個很好的 HPLC 定量分析方法的原因。
結論白毛莨室溫萃取法簡便而可靠，萃取物采用 Zorbax EclipseXDB-C18 快速分離色譜柱進行等度 HPLC 分析，在 15 分鐘內(nèi)獲得了 6 種生物堿的分離結果，分離度高，峰形好。該分析方法提供了包括小檗堿和白毛莨堿在內(nèi)的白毛莨生物堿含量的可靠定量結果。該方法已通過分析來自 3 個不同供貨商的白毛莨得到了驗證，預期也可用于其它含小檗堿植物的分析。