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液相色譜儀改進對生物樣品中代謝物的分離
閱讀：406 發(fā)布時間：2023-4-24引言：在藥代動力學(DMPK)研究中，體外和體內實驗的目的都是鑒定與藥物相關的組分 [2,3]。當某些特殊代用配置亞 2 微米粒徑色譜柱的液相色譜儀改進對生物樣品中代謝物的分離應用謝物只用 LC-MS 鑒定還不夠，需要更多結構信息時，用 LC 分離就成了關鍵步驟，要為核磁共振（NMR）分析等其它鑒定方法提供樣品。代謝物要從各種復雜基質中分離，如血漿、尿液、糞便、肝臟和膽汁。在亞 2 微米小粒徑柱提供的快速和高分離度的推動下，對常規(guī) HPLC 方法重新評價，是否能作為一種縮短代謝物分離時間的方法[4, 5]。
實驗高分離度快速液相色譜用一些實驗來確定，在高分離度快速液相色譜（RRLC）系統(tǒng)上用 1.8 微米色譜柱是否改善了色譜分離。所用的 RRLC 系統(tǒng)見圖 1。• 1200 系列 SL 型二元泵，配置微量真空脫氣機• 1200 系列高性能自動進樣器• 1200 系列柱溫箱• 1200 系列高速可變波長檢測器• 1100 系列分析級餾分收集器色譜柱采用幾種不同柱長和填料粒徑的 ZORBAX SBC18。為了保持恒定的樣品加載量和流速，內徑固定在 4.6 mm。要獲得合適體積的餾分，流速設置約為1 mL/分鐘。所用色譜柱的詳細情況如下：
• 4.6 x 250 mm, 5 µm, 部件號 880975-906• 快速分離 4.6 x 150 mm, 3.5 µm，部件號 863953-902• 快速分離高通量 4.6 x 150 mm, 1.8 µm，部件號829975-902• 快速分離高通量 4.6 x 100 mm, 1.8 µm，部件號828975-902相關的方法參數(shù)包括：流動相 A: 10 mM 醋酸銨，用醋酸調至 pH 5.0，流動相 B: 75:25 乙腈: 甲醇?？勺儾ㄩL檢測器(VWD)檢測波長 235 nm，峰寬設置 > 0.005 分鐘，或 0.12-秒響應時間，配置標準流通池(部件號 G1314-60086)。
原方法(4.6 x 250 mm 柱)的梯度表如下：時間 %B0 2035 3550 5555 10055.1 到 60 20快速分離（RR）和快速分離高通量（RRHT）柱越短，時間將成比例地縮短。
樣品尿樣的分析結果見圖 2 和圖 3。尿液樣品的制備包括，取 10 倍量的尿液在室溫下真空離心干燥濃縮，然后用起始流動相復溶。進樣前，樣品再次離心，去除微粒。這種方法也可以用于血漿、肝臟勻漿和糞便勻漿。樣品制備包括，用三倍體積的溶劑（1:3，樣品：乙腈）旋渦混合分別提取三次，并離心。取出上清，混合，干燥。提取物用起始流動相復溶，離心，然后進樣。在大多數(shù)情況下，膽汁可以不經過樣品制備直接進樣。10 20 30 40 50 minmAU010020010 20 30 40 50 minmAU010020010 20 30 minmAU010020010 20 30 minmAU010020010 20 minmAU0100200M5 M13 M15M5 M13 M15 M17M5M13 M15M17M5M13 M15M17RR SB-C18 4.6 × 150 mm, 3.5 µmSB-C18 4.6 × 250 mm, 5 µmRRHT SB-C18 4.6 × 150 mm, 1.8 µmRRHT SB-C18 4.6 × 100 mm, 1.8 µm???: A: 10 mM ????????? pH 5.0 B: 75:25 (??ǖ??(?? :????????????: 1.0 mL/min???: 100 µL (?????????)?? :25 °C??: UV 232 nm??: ??????????????????M17圖 2. SB-C18 柱的可縮放性提高了 DMPK 代謝物分離方法的通量尿樣分析的結果見圖 1 和圖 3。鑒定出的感興趣藥物代謝物為色譜圖中的 M5、M13、M15 和 M17。
結果與討論在我們實驗室里，因為待測樣品的復雜性，用4.6 mm x 250 mm, 5 微米柱進行色譜分析的時間，可能在 60 分鐘到 3 個小時。本研究的目標就是要用現(xiàn)有的方法，在保持分離度和測試量的同時，縮短分析時間。
每次進樣加載物質的量部分地決定了所用的柱內徑。通常，感興趣的代謝物以每毫升納克到微克水平存在于基質中，大量內源性物質占樣品中的絕大部分。為了從內源性物質中獲得最大量的代謝產物，經常要使色譜柱超載。大量內源性物質加載到色譜柱上，導致超載，影響色譜分離的完整性。要減少內源性物質與感興趣代謝物的共洗脫，必須采取少量多次進樣。對這種長達 1 小時的分析，多次進樣只分離非常少量的物質，顯得相當浪費時間。雖然我們實驗室不要求高通量，但提高通量還是很重要。這里顯示的是用 Agilent 1200 系列高分離度快速液相色譜快速分離柱得到的結果。代謝研究中經常要用 14C 同位素標記化合物，將其作為一種有效方法，鑒定被內源性化合物背景掩蓋下的藥物相關物質。用亞 2 微米色譜柱進行的這類研究將在以后的論文中發(fā)表。這里分析的是第一次從人體實驗得到的樣品，藥物沒有標記 14C 同位素標記。為了分離制備，只監(jiān)測和報告了 UV 響應。
在圖 2 中，顯示了對尿樣分析的比較，樣品中需要分離的代謝物水平非常低。原來在 ZORBAX SB-C184.6 mm x 250 mm, 5 µm 柱上建立的方法，分析時間為 60 分鐘。本樣品在用于比較的 4.6 mm x 100 mm,1.8 µm 柱和 4.6 mm x 150 mm, 1.8 µm 及 3.5 µm 柱上分離。梯度曲線按柱長比例更改。正如所期望的，隨著粒徑和柱長的減少，分離度和UV 響應都有了增加。對每根色譜柱每種代謝物 UV響應和峰寬的比較見表 1。每種代謝物的峰形都有明顯改善，可以看到理論塔板數(shù)的增加。請注意，如果用更小的 2.1 µm 內徑柱，柱效還有可能進一步改善。圖 2 還顯示了方法的耐用性和用 SB-C18 的可縮放性。不同的柱子配置，包括粒徑和長度，對選擇性的影響很小。從四種分離都具有相同的洗脫曲線就可以看出這一點。由于為了每次分析純化出最大量的代謝物，有意識地讓色譜柱超載，所以感興趣的峰有拖尾現(xiàn)象。
結論結果表明 RRHT 技術提高了實驗室的效率。用 RRHT柱取代常規(guī)色譜柱，在不影響分離度的情況下，提高了通量。最大的收獲是用更小粒徑(1.8 或 3.5 um)色譜柱，分離度的提高最大。用 RRHT 柱取代了常規(guī)尺寸色譜柱后，峰高和峰寬都有了改善。另外，分析時間與柱長成比例地縮短。這些優(yōu)點將帶來實驗室效率的提高。本方法在對復雜基質進行分析時（例如，尿和血漿）很容易在不同配置的 SB-C18 柱（包括不同的粒徑）之間放大和縮小，最大限度地簡化了樣品制備。
