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快速高分離度 LC/MS/MS 定量測(cè)定麥片中的水溶性 B 族維生素
閱讀：543 發(fā)布時(shí)間：2023-4-16引言水溶性維生素極性很強(qiáng)，在反相色譜柱上保留很差。在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑，如七氟丁酸能夠明顯改善這類化合物的分離和保留。然而，使用這類離子對(duì)也有缺點(diǎn)，它會(huì)在質(zhì)譜儀中產(chǎn)生較高的背景信號(hào)。因此，我們使用具有專門保留親水性化合物鍵合相的色譜柱，在流動(dòng)相溶劑中加入甲酸銨，開發(fā)出快速靈敏的分析方法。本文使用的 Agilent 1200 系列液相色譜（LC）系統(tǒng)和亞-2-微米填料色譜柱用于快速高分離度分離。該LC 系統(tǒng)設(shè)計(jì)降低了延遲體積，增加了壓力范圍和柱溫。將該 LC 系統(tǒng)通過 G1948B 電噴霧離子源與Agilent 6410 三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（QQQ）相連接。目標(biāo)化合物采用加入甲酸銨的水 - 甲醇梯度在ZORBAX AQ 1.8 µm 色譜柱上實(shí)現(xiàn)分離。測(cè)定水溶性維生素的普通的 LC/MS 方法是在流動(dòng)相溶劑中加入七氟丁酸作為離子對(duì)試劑，其分析時(shí)間長(zhǎng)達(dá) 30 分鐘。我們開發(fā)出快速、靈敏的 LC/MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀 方法用于水溶性維生素的測(cè)定，該法采用高效 1.8 µm色譜柱在低擴(kuò)散、600 bar LC/MS 配置下將允許篩選和定量的運(yùn)行時(shí)間周期低至 10 分鐘。質(zhì)譜儀的線性響應(yīng)超過三個(gè)數(shù)量級(jí)，除吡哆醇外的所有被測(cè)物具有0.5 pg/µL 的定量限。吡哆醇的分析具有良好的靈敏度，但良好的線性恰好被局限在三個(gè)數(shù)量級(jí)之內(nèi)。對(duì)于除吡哆醇之外的所有化合物得出了濃度介于0.5 ～ 500 pg/µL 之間（吡哆醇介于 0.5 ～ 250 pg/µL之間）的校正曲線和色譜圖。B 族維生素的結(jié)構(gòu)示于圖 1。
實(shí)驗(yàn)部分樣品制備含有所有八種化合物的混標(biāo)甲醇溶液由 ConAgra 食品公司提供，使用含 20 mM 甲酸銨和 0.1% 甲酸的10% 甲醇水溶液稀釋至如下濃度：500、250、100、50、5 和 0.5 pg/mL。這些稀釋液用于未知樣品的定量測(cè)定。再提供一種按下列方法制備的添加 B 族維生素的樣品，制備方法如下：
使用攪拌器將早餐麥片研磨均勻；2. 稱取 1 克研勻的樣品轉(zhuǎn)入 50 mL 樣品瓶中；3. 加入 25 mL 0.1 M HCl，在 100 °C 水浴中加熱 20分鐘，以溶解維生素；4. 冷卻至室溫；5. 用去離子水調(diào)整體積至 1 L ；6. 用 0.45 µm 玻璃微纖維素膜過濾。應(yīng)該指出，提供的添加樣品是為測(cè)試儀器的靈敏度而研制，以向顧客演示為目的。一種典型的未添加樣品的提取由以下步驟組成：取 1 克研勻的樣品用酶消化處理以將天然存在的維生素從其結(jié)合形式中釋放出來(lái)，定容至 10 mL，取其體積的 1/100 用于本研究所分析的添加樣品。在較高的濃度下，可看到鹽和其它基質(zhì)成分對(duì)某些維生素的分析產(chǎn)生干擾。因此，可以采用進(jìn)一步稀釋的辦法調(diào)節(jié)這些樣品中的基質(zhì)效應(yīng)。
維生素 B12 母離子的質(zhì)量（m/z 678.6）大約是圖 1中給出的該化合物實(shí)驗(yàn)式（C63H88CoN14O14P）計(jì)算值的一半。相信此化合物不太穩(wěn)定，在離子化過程中發(fā)生了裂解。
結(jié)果與討論 ：有八個(gè)化合物的校正曲線示于圖 2A ～ 2H。只有化合物吡哆醇在 500 ppb 水平?jīng)]有得到良好的線性，本實(shí)驗(yàn)未加內(nèi)標(biāo)。