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液質(zhì)聯(lián)用儀對尿樣中的阿片類化合物進(jìn)行定量分析
閱讀：713 發(fā)布時間：2023-4-11阿片類化合物是一類藥用化合物，通常用于鎮(zhèn)靜和緩解疼痛，既可能作為處方藥合法地獲得，也可能通過非法手段獲取。阿片類化合物的濫用常常會導(dǎo)致成癮。出于一些原因，包括治療藥物監(jiān)測、在藥物影響下駕駛以及工作場所藥物測試等，通常會對這些化合物進(jìn)行分析，尤其是對尿樣進(jìn)行分析，因為尿樣易于獲得且樣品量充足。在法醫(yī)領(lǐng)域的檢測中，如果該類化合物的含量超過管制值，還需要提供另外的確證信息以證明它們的存在。三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀能夠提供靈敏度最高的定量方式，即采集由被分析物母離子裂解產(chǎn)生的具有最高響應(yīng)的子離子（定量離子）的相關(guān)信號。這種裂解轉(zhuǎn)變被稱為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。其次，通過采集次高響應(yīng)的子離子（定性離子）的附加信號，可以認(rèn)為能夠獲得足夠的結(jié)構(gòu)確證信息，尤其是當(dāng)兩種子離子的信號比在校正標(biāo)準(zhǔn)品和未知樣品中保持一致時更是如此。使用液質(zhì)聯(lián)用儀同時采集定量離子和定性離子的 MRM 信號能夠同時得到定量測定和結(jié)構(gòu)確證結(jié)果。
安捷倫 MassHunter 軟件在其定量分析程序中包含用戶自定義離子比確證信息，如圖 1 所示。用于確證的裂解離子比的缺省偏差限值為 ±20%，對于特殊用戶，該值也可由用戶自己設(shè)定。另外，最多可有四個不同的子離子被設(shè)為定性離子。本文中，使用了缺省值±20% 且僅用一個定性離子。
本文使用梯度液相色譜系統(tǒng)，在 1.8 µm 粒徑的快速分離高通量（RRHT）色譜柱上，在 3.5 分鐘內(nèi)對所有被分析物和相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行洗脫，所用的流動相僅包含水和乙腈（不含改性劑）。從一次進(jìn)樣到下一次進(jìn)樣之間的完整周期約為 8 分鐘。這些化合物使用電噴霧離子源以正離子模式進(jìn)行分析。與該離子源有關(guān)的參數(shù)如干燥氣，與液相色譜的流速 0.4ml/min相適應(yīng)，樣品將由此導(dǎo)入質(zhì)譜儀。
從離子源向液質(zhì)聯(lián)用儀質(zhì)量分析器的最大離子轉(zhuǎn)移電壓由儀器的自動調(diào)諧功能進(jìn)行設(shè)置，可以在較寬的質(zhì)量范圍內(nèi)獲得優(yōu)化的信號強度、分離度和質(zhì)量確證。一個需要根據(jù)每個被分析物進(jìn)行優(yōu)化的參數(shù)是碰撞誘導(dǎo)解圖 2. 本文中分析的阿片類化合物的結(jié)構(gòu)式離電壓，它位于離子源和質(zhì)量分析器之間的離子轉(zhuǎn)移光學(xué)元件之上。通過優(yōu)化，能夠使得 QQQ 質(zhì)量分析器中第一個四極桿上的母離子響應(yīng)值最大。本次研究中采用 110 V 的碰這些參數(shù)設(shè)定之后，即可獲得將母離子裂解形成最高響應(yīng)的子離子的優(yōu)碰撞能量。至此，關(guān)于定量離子的質(zhì)譜方法學(xué)研究工作結(jié)束。接著，對次高豐度的子離子的碰撞能量重新進(jìn)行優(yōu)化，以上兩種 MRM 是由同一化合物裂解而來的。上述優(yōu)化步驟可以通過流動注射分析進(jìn)行。
實驗部分樣品制備添加阿片類化合物的尿樣有以下標(biāo)示濃度：1，5，10，50，100 和 150 pg/µL，而 6-MRM 的標(biāo)示濃度要低 15 倍。這些樣品按下述步驟進(jìn)行處理：1. 起始樣品量為 250 µL2. 加醋酸鈉緩沖液 500 µL3. 加葡萄糖苷酸酶 20 µL4. 加濃度為 500 ng/mL 的內(nèi)標(biāo)混合物（去離子水溶液）75 µL5. 渦旋振蕩6. 60 °C 保溫 2 小時7. 加去離子水 850 µL8. 渦旋振蕩并離心9. 取上清液 200 µL 至樣品瓶中所有制備好的樣品均由客戶提供。經(jīng)過以上處理步驟，樣品濃度稀釋因子為 6.78，因此原尿樣中 1 pg/µL 的濃度，其處理后進(jìn)樣的實際濃度為 147 fg/µL。通過加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和提取，各起始濃度的尿樣其對應(yīng)的進(jìn)樣濃度如下：0.147，0.737，1.47，7.37，14.7 和 22.12 pg/µL。按進(jìn)樣量 5µL（參見色譜條件）計算，以上濃度對應(yīng)的柱上含量為0.737，3.685，7.35，36.85，73.5 和 110.6 pg。對于6-乙酰，各濃度值均為以上數(shù)值除以 15。
LC/MS 方法詳細(xì)說明LC 條件Agilent 1200 系列二元泵，脫氣機，多孔板進(jìn)樣器，以及柱溫箱。色譜柱： 安捷倫 ZORBAX SB-C18，2.1 x 50 mm，1.8 µm 粒徑（部件號：822700-902）柱溫： 50 °C流動相： A= 水B= 乙腈流速： 0.4 mL/min進(jìn)樣量： 5 µL梯度：時間（分鐘） %B0 24 40 Stop time: 6.1 分鐘4.1 90 Post time: 2.0 分鐘6 906.1 2進(jìn)樣針清洗（25:75 水/甲醇）— 沖洗進(jìn)樣針口 10 秒質(zhì)譜條件模式： 使用安捷倫 G1948B 離子源的電噴霧離子化正離子模式霧化器： 60 psig干燥氣流速： 11 L/min干燥氣溫度： 350 °CVcap： 2000 V分離度（FWHM）： Q1=0.7 ； Q2=0.7所有 MRM 的駐留時間 =50 毫秒所有轉(zhuǎn)變的碰撞誘導(dǎo)解離電壓 =110 V每個化合物的 MRM 及其保留時間見表 1。圓括號中的子離子為定性離子，其保留時間也在圓括
結(jié)果與討論所有七個化合物的校正曲線如圖 3A 至 3G 所示，包括三個低濃度的放大圖。所有校正曲線由線性方程擬合而成，不強制過原點，權(quán)重設(shè)為 1/x。所有曲線的線性相關(guān)系數(shù)均不低于 0.99，并且在低濃度水平顯示出良好的重現(xiàn)性和精密度。只有一個例外，其低濃度（柱上 49 fg）的三次進(jìn)樣中僅有兩次有信號。然而，其對應(yīng)的尿樣濃度0.067 pg/µL（0.067 ng/mL）已遠(yuǎn)低于美國藥物濫用與精神衛(wèi)生服務(wù)管理局（SAMHSA）規(guī)定的工作場所測試管制值 10 ng/mL。