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高分辨SID-EMR Orbitrap儀器研制及大蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)測(cè)定
閱讀：747 發(fā)布時(shí)間：2019-3-9近日俄亥俄州立大學(xué)化學(xué)和生物化學(xué)系的VickiH. Wysocki教授課題組在AC上發(fā)表了一篇文章，題目為Surface-InducedDissociation of Noncovalent Protein Complexes in an Extended Mass RangeOrbitrap Mass Spectrometer。
獲取蛋白質(zhì)復(fù)合物的四級(jí)結(jié)構(gòu)信息，對(duì)于理解其生物功能來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。與傳統(tǒng)的CID/HCD通過(guò)多次碰撞沉積能量以實(shí)現(xiàn)解離相比，表面誘導(dǎo)解離(Surface induceddissociation，SID)是通過(guò)使復(fù)合物離子撞擊一個(gè)具有化學(xué)惰性、剛性的表面，經(jīng)過(guò)單次高能撞擊后，產(chǎn)生相比于CID和HCD技術(shù)電荷更均勻分布的蛋白亞基，從而提供化學(xué)計(jì)量比和互作網(wǎng)絡(luò)等信息。此外，相比于CID常常導(dǎo)致小分子配體丟失，SID可以產(chǎn)生保留小分子配體的復(fù)合物亞基。
目前，SID技術(shù)在蛋白復(fù)合物方面的工作主要是在飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOF MS)上完成，但隨著蛋白復(fù)合物的分子量越來(lái)越大，結(jié)構(gòu)解析深度越來(lái)越深入，對(duì)質(zhì)譜儀器的分辨率也提出了更高的要求。每一種類型的質(zhì)量分析器(TOF、FTICR或者Orbitrap)都有它們的優(yōu)劣勢(shì)，而儀器的選擇主要依賴于待解決的問(wèn)題本質(zhì)。為此，Vicki H. Wysocki課題組與賽默飛公司Alexander A. Makarov博士合作，將SID解離源裝配到Exactive Plus Extended Mass Range(EMR)Orbitrap儀器上(如圖2)。這套SID即可用來(lái)傳輸離子又可用來(lái)進(jìn)行SID。值得一提的是，SID裝置并未影響離子進(jìn)入HCD池和一級(jí)質(zhì)譜分析。
隨后，作者利用該儀器對(duì)Streptavidin和L-GlutamateDehydrogenase蛋白復(fù)合物進(jìn)行了質(zhì)譜分析。其中，前者是具有D2對(duì)稱性的同源四聚體，后者是具有D3對(duì)稱性的同源六聚體。圖3為Streptavidin的一級(jí)譜及其SID譜圖。先前的文獻(xiàn)表明，通過(guò)CID主要產(chǎn)生的是streptavidin復(fù)合物的去折疊單聚體和三聚體，但這一結(jié)果顯然不能支持streptavidin是由同源二聚體組成的結(jié)構(gòu)。而11+的母體streptavidin復(fù)合物經(jīng)過(guò)SID會(huì)解離成兩個(gè)二聚體，分別為5+和6+，證明SID更能反映他們真實(shí)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖3a-c)。值得一提的是，之前對(duì)于譜圖中出現(xiàn)的3+單聚體和6+同源二聚體，由于TOF MS分辨率不高所以要依靠IMS才能進(jìn)行分辨3，但現(xiàn)在EMR Orbitrap在高分辨率模式(R=140,000 at m/z 200)下就可直接對(duì)它們二者進(jìn)行分辨(圖3d)，甚至鹽加和離子或者N末端Met修飾與否都可以在高分辨譜圖中*獲得(圖3e)。
a)Streptavidin四聚體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(PDB ID：1SWB)，b)Streptavidin四聚體一級(jí)質(zhì)譜圖，c)11+價(jià)態(tài)Streptavidin四聚體的SID譜圖(45 V，495 eV)，d)高分辨率模式下3+價(jià)態(tài)Streptavidin單聚體和6+價(jià)態(tài)的二聚體，e)3+價(jià)態(tài)單聚體和6+價(jià)態(tài)二聚體的N末端蛋氨酸修飾和Na離子加和譜圖。
此外，作者還考察了L-Glutamate Dehydrogenase同源六聚體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。HCD結(jié)果表明，該六聚體很難在氣相中發(fā)生解離，需要較高HCD能量和高電荷態(tài)，常常導(dǎo)致先失去一個(gè)去折疊單體，無(wú)法真實(shí)反映亞基組成。而通過(guò)SID可以獲得比較穩(wěn)定的三聚體信號(hào)，反映出L-GlutamateDehydrogenase同源六聚體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)主要為三聚體-三聚體界面，在低能量下主要斷裂較弱的三聚體界面(圖4a)，當(dāng)能量逐漸升高單體會(huì)從三聚體亞基中解離出來(lái)(圖4b)。
綜上所述，相比于SID-TOF MS儀器，具有更高質(zhì)譜分辨率的SID–EMR Orbitrap儀器后續(xù)將為大蛋白復(fù)合物提供更豐富的四級(jí)結(jié)構(gòu)信息。此外，Vicki H. Wysocki課題組先前還報(bào)道了將SID裝載到FTICR-MS儀器，在SID譜圖中可對(duì)霍亂毒素(Cholera toxin B，CTB)多種亞基進(jìn)行同位素分辨(R=210,000 at m/z 5803.7)，例如8+四聚體、6+三聚體、4+二聚體和2+單聚體4，感興趣的學(xué)者們可進(jìn)一步了解。得益于Orbitrap和FTICR的超高質(zhì)量分辨率，相信SID源將在蛋白-蛋白、蛋白-金屬離子、蛋白-小分子配體復(fù)合物體系中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。