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【概述】

威士忌酒是一種常見(jiàn)的烈性酒。其蒸餾工藝歷史悠久、源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，其中還涉及非常復(fù)雜的陳釀過(guò)程。具體來(lái)說(shuō)，要先將多種谷物和水混合制成酒漿并利用酵母進(jìn)行發(fā)酵，再進(jìn)行蒸餾，然后還要在木桶或酒桶中進(jìn)行陳釀。1經(jīng)過(guò)這種復(fù)雜的傳統(tǒng)工藝處理的成品酒的酒精含量很高，不過(guò)批次間的差異也巨大。舉例來(lái)講，產(chǎn)自蘇格蘭島西海岸的威士忌酒通常帶有濃重的煙熏味，而產(chǎn)自斯貝塞區(qū)的酒則富有蜂蜜，香草的香甜和濃濃果香。2制酒技術(shù)通常會(huì)對(duì)酒的化學(xué)組成產(chǎn)生重要影響，從而影響終成品酒的風(fēng)味。

 

正是由于這些*之處，加之其需求的不斷增長(zhǎng)，威士忌酒已經(jīng)成為世界上很多地區(qū)的重要商品。而整個(gè)威士忌酒業(yè)也成為這些地區(qū)的雇傭主體和稅收支柱。舉個(gè)例子，對(duì)于英國(guó)經(jīng)濟(jì)來(lái)說(shuō)，威士忌酒業(yè)的市場(chǎng)價(jià)值約為50億英鎊，3而整個(gè)烈酒市場(chǎng)在美國(guó)的價(jià)值總和約為1200億美元。4由于威士忌酒零售價(jià)格普遍較高，市面上充斥著大量偽劣商品，對(duì)威士忌酒業(yè)的生存和發(fā)展構(gòu)成相當(dāng)大的威脅。造假的手段五花八門(mén)，規(guī)模大小不一。普遍的一種方式是將威士忌酒的主要已知化學(xué)成分加入某種低價(jià)烈酒中，以這種“人造產(chǎn)品”冒充威士忌。這種方式也令人擔(dān)心，因?yàn)樵旒僬吒静豢赡芤?guī)范控制化學(xué)物質(zhì)添加的種類(lèi)、質(zhì)量和濃度。

 

另一種造假的主要形式是以次充好，夸大威士忌酒陳釀的年數(shù)。因?yàn)橥考傻念伾疃雀愥劦哪陻?shù)正相關(guān)，造假者會(huì)在酒中添加色素或在陳釀過(guò)程中加熱以模仿陳釀的色澤，或在灌裝時(shí)故意使用不相符的標(biāo)簽來(lái)夸大陳釀的年數(shù)來(lái)在市場(chǎng)上謀取暴利。這兩種造假的方法都能夠快速地在數(shù)月甚至數(shù)日之中得到正常需要數(shù)年才能得到的酒品外觀。

 

因此，對(duì)威士忌酒釀造商來(lái)說(shuō)，能夠使用現(xiàn)有的分析技術(shù)準(zhǔn)確、全面地表征他們的產(chǎn)品至關(guān)重要，因?yàn)檫@樣有助于對(duì)假貨的準(zhǔn)確識(shí)別和整治，使得他們能夠有效地保護(hù)自己的產(chǎn)品和品牌。此外，對(duì)于威士忌酒釀造商來(lái)說(shuō)，把產(chǎn)品的化學(xué)輪廓描繪分析納入質(zhì)控流程的好處還不止于此。因?yàn)榛瘜W(xué)輪廓分析的結(jié)果還有助于他們比較不同批次產(chǎn)品的差異，及時(shí)發(fā)現(xiàn)釀造過(guò)程中出現(xiàn)的變化。這樣一來(lái)，他們就能更有效地保證他們灌裝的成品酒品質(zhì)始終如一，符合消費(fèi)者期待的特色風(fēng)味和特征。

【實(shí)驗(yàn)/設(shè)備條件】

表2. GC和進(jìn)樣器條件

表3.質(zhì)譜儀條件

【樣品提取】

 

本研究中共包括了九種威士忌酒樣品，樣品詳細(xì)信息參見(jiàn)表1。為GC分析進(jìn)行的樣品前處理程序如下：將3 mL威士忌酒樣品與10 mL蒸餾水混合，再加入15 mL乙酸乙酯振蕩，將有機(jī)相通過(guò)3 g硫酸鈉。在室溫下借助溫和氮?dú)饬鞔蹈梢宜嵋阴ポ腿∫海儆?.5 mL乙酸乙酯重懸并轉(zhuǎn)移至GC樣品瓶?jī)?nèi)。

將每種酒的萃取液取50 µL在GC樣品瓶中進(jìn)行混合，制成復(fù)合樣品以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。此外，以空白乙酸乙酯樣品作為對(duì)照，以排除背景中存在的峰。對(duì)每個(gè)樣品，包括復(fù)合樣品，以隨機(jī)順序進(jìn)行四次重復(fù)進(jìn)樣分析。

表1.研究涉及的威士忌酒樣品詳細(xì)信息

【實(shí)驗(yàn)/操作方法】

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）被廣泛用于的威士忌酒表征分析，因?yàn)樗哂猩V分辨率好、重現(xiàn)性高、峰容量高等優(yōu)點(diǎn)，尤其是成熟的GC-MS數(shù)據(jù)庫(kù)能非常有效地幫助實(shí)現(xiàn)酒中揮發(fā)性和半揮發(fā)性化學(xué)成分的鑒定。在本概念驗(yàn)證性研究中，我們希望利用Thermo Scienti?cTM Q ExactiveTM GC混合四極桿-OrbitrapTM質(zhì)譜儀出色的分析表現(xiàn)來(lái)對(duì)不同產(chǎn)地、年份、和類(lèi)型的威士忌酒進(jìn)行輪廓描繪分析。

 

本研究的另一個(gè)目標(biāo)是對(duì)使用Q Exactive GC系統(tǒng)，通過(guò)一個(gè)完整的非定靶化學(xué)計(jì)量工作流程，進(jìn)行威士忌酒中化學(xué)成分的檢測(cè)和鑒定的方法和效果進(jìn)行評(píng)估。本文中也可見(jiàn)不同產(chǎn)地威士忌酒的化學(xué)成分存在差異。

樣品分析在高質(zhì)量分辨能力下使用全掃非定靶采集方式進(jìn)行，以獲得質(zhì)量數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)對(duì)于實(shí)現(xiàn)元素組成分析、區(qū)分樣品與共洗脫等質(zhì)量干擾化合物非常重要。高掃速與大動(dòng)態(tài)定量范圍和高靈敏度的組合使得檢測(cè)高、低豐度的成分都易如反掌。這些特性與*軟件算法的結(jié)合能夠支持自動(dòng)解卷積，并完成數(shù)據(jù)的解析和樣品對(duì)比，為酒品的全面分析、質(zhì)量控制、和品牌管理保護(hù)提供了強(qiáng)大的工具支撐。

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果/結(jié)論】

驗(yàn)證性研究的目的是使用非定靶全掃數(shù)據(jù)采集法分析威士忌酒樣品、使用統(tǒng)計(jì)工具鑒定樣品間是否存在差異，并初步鑒定出所有觀察到的差異物質(zhì)。此外，另一個(gè)目的是通過(guò)質(zhì)量數(shù)推理和譜圖匹配對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行化學(xué)成分表征。圖1總結(jié)了達(dá)成這些目標(biāo)所需的工作流程。

圖1.用Q Exactive GC系統(tǒng)進(jìn)行化學(xué)輪廓描繪和標(biāo)志物鑒定的工作流程

 

發(fā)現(xiàn)樣品間的差異

對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行四次重復(fù)進(jìn)樣分析并獲得全掃色譜圖。圖2給出了一份單一純麥樣品和一份波本威士忌酒樣品的總離子流圖（TICs）實(shí)例，圖中可見(jiàn)大量不同強(qiáng)度的峰出現(xiàn)在各個(gè)保留時(shí)間。對(duì)化學(xué)輪廓描繪分析來(lái)說(shuō)非常重要的一點(diǎn)是，Q ExactiveGC系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)定量區(qū)間范圍非常大，使得同時(shí)準(zhǔn)確捕捉痕量成分和高濃度成分成為可能。用SIEVE 2.2軟件處理全部數(shù)據(jù)，包括9份樣品、復(fù)合樣品、和重復(fù)分析的數(shù)據(jù)，進(jìn)行組分提取和統(tǒng)計(jì)分析。軟件會(huì)首先進(jìn)行色譜峰對(duì)齊操作以校正分析間的保留時(shí)間漂移，然后再進(jìn)行譜峰檢測(cè)和后的統(tǒng)計(jì)分析。分析結(jié)果參見(jiàn)圖3，圖中顯示的是對(duì)所有樣品和重復(fù)分析結(jié)果進(jìn)行主成分分析（PCA）的結(jié)果。目測(cè)來(lái)看，每份威士忌酒樣品的重復(fù)分析數(shù)據(jù)顯然聚類(lèi)在一起，而混合樣品如預(yù)期般位于PCA圖的中心位置。

圖2.純麥威士忌酒（樣品2265）和波本威士忌酒（樣品2295）的GC-MS總離子流譜圖.

圖3.將9份威士忌酒樣品進(jìn)行4次重復(fù)分析的數(shù)據(jù)由SIEVE軟件進(jìn)行主成份分析所得模型。請(qǐng)注意，所有的重復(fù)分析數(shù)據(jù)都正確地聚類(lèi)在一起。而威士忌酒樣品2295（波本威士忌）和2265（在三個(gè)酒桶中進(jìn)行過(guò)陳化）雖然與其它樣品明顯不同，但彼此卻有相似之處。

分離*成分

基于PCA分析結(jié)果和SIEVE 2.2生成的譜峰列表，我們可以分析不同樣品類(lèi)型之間的差異主要是由哪些峰造成的。從

PCA分析中得到的一個(gè)有趣結(jié)果是樣品2295和2265與其它樣品明顯有差異。對(duì)含有4841個(gè)組分的列表（包含保留時(shí)間和相應(yīng)的質(zhì)量數(shù)）根據(jù)p值（<0.05）進(jìn)行排序以保證統(tǒng)計(jì)上的顯著性，結(jié)果有效揭示出樣品2295中有大量*化合物和這些化合物濃度顯著升高、并且在四份重復(fù)分析中顯示出一致的組分峰。我們對(duì)統(tǒng)計(jì)差異位列前五的譜峰進(jìn)行了分析，結(jié)果參見(jiàn)表4。

 

具體來(lái)說(shuō),如SIEVE 2.2的強(qiáng)度變化趨勢(shì)圖（圖4）所示，首先發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間13.6分鐘處的譜峰在樣品2295中顯著高于所有其它樣品。下一步是根據(jù)質(zhì)量數(shù)推測(cè)元素組成，嘗試鑒定出組分峰化學(xué)結(jié)構(gòu)。這一步可能會(huì)非常困難，同時(shí)使用EI譜圖和PCI譜圖會(huì)有些幫助。還可以用EI譜圖去搜索諸如NIST等商用譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)以得到可能的化合物，并使用準(zhǔn)確質(zhì)量信息來(lái)支持或排除鑒定結(jié)果。如果EI譜圖搜不出結(jié)果，可以用PCI數(shù)據(jù)推測(cè)分子離子可能的元素組成。的質(zhì)量準(zhǔn)確度對(duì)于縮減可能的化學(xué)分子式列表和提高鑒定結(jié)果的可靠性至關(guān)重要。

表4.樣品2295中濃度升高的五個(gè)譜峰及其可能的鑒定結(jié)果總結(jié)表

 

為簡(jiǎn)化13.6分鐘處譜峰的鑒定，將原始數(shù)據(jù)用TraceFinder軟件解卷積化生成一張更為“干凈”的譜圖，然后再與NIST 14進(jìn)行搜索匹配（圖5）。搜索NIST譜庫(kù)所得結(jié)果再根據(jù)正匹配指數(shù)（SI）得分和高分辨過(guò)濾分值（HRF）進(jìn)行評(píng)分。HRF值實(shí)際上就是搜庫(kù)所得化學(xué)分子式所能解釋的譜圖比例。以佳結(jié)果反式β-紫羅蘭酮為例，譜圖中高達(dá)98.4%的內(nèi)容都可以根據(jù)離子的準(zhǔn)確質(zhì)量找到解釋。譜圖中觀察到的碎片離子也都可以匹配到推斷化合物的結(jié)構(gòu)單元上，更提高了鑒定結(jié)果的可信度，也有助于解釋這些碎片是如何在推測(cè)化合物的基礎(chǔ)上形成的。后SI和HRF的綜合得分為75.3%。圖6顯示的是EI譜圖中的碎片離子峰，圖中標(biāo)記出了推測(cè)分子元素組成和質(zhì)量偏差。所有碎片離子的實(shí)測(cè)值和理論值之差都在小于1 ppm，使得結(jié)果更為可靠。反式β-紫羅蘭酮是胡蘿卜素的裂分產(chǎn)物，其濃度在樣品2295（波本威士忌酒）中有顯著升高。波本威士忌和蘇格蘭威士忌的一個(gè)重要區(qū)別在于，波本威士忌是用玉米而不是大麥釀制的。玉米中天然β-胡蘿卜素的含量高于大麥（玉米含量為53 µg/200 g，大麥含量為7 µg/200g5），因此檢測(cè)到的濃度差異可以在這里找到解釋。

圖5. 13.6分鐘處的峰被鑒定為反式β-紫羅蘭酮。TraceFinder 3.3中解卷積化數(shù)據(jù)及譜庫(kù)搜索結(jié)果的截屏圖。譜庫(kù)搜索結(jié)果列表，排的結(jié)果，反式β-紫羅蘭酮，能解釋75.3%的譜圖內(nèi)容（上圖）。實(shí)采譜圖與數(shù)據(jù)庫(kù)譜圖的鏡像比較圖（下圖）。

圖6.標(biāo)記了分子式和質(zhì)量偏差（ppm）的反式β-紫羅蘭酮EI碎片譜圖。分子離子和前六個(gè)強(qiáng)度高的碎片支持鑒定結(jié)果，質(zhì)量準(zhǔn)確度< 1 ppm。R =分辨率。

圖7. 18.00分鐘處譜峰的EI圖，譜庫(kù)搜索未產(chǎn)生匹配結(jié)果。圖中標(biāo)注出了每個(gè)峰的結(jié)構(gòu)、分子式和質(zhì)量偏差（ppm）。質(zhì)量偏差小于1 ppm，使得鑒定結(jié)果，3-羰基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸，高度可信。譜峰注釋根據(jù)Mass Frontier 7.0中生成的結(jié)果進(jìn)行。

圖8. SIEVE軟件對(duì)同一釀酒廠不同陳化年份的威士忌酒生成的PCA圖。重復(fù)進(jìn)樣分析結(jié)果一致。

 

產(chǎn)自同一釀酒廠的威士忌酒間的差異

對(duì)本次研究產(chǎn)生數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析是比較同一間釀酒廠出產(chǎn)而陳化年份或陳化過(guò)程不同的威士忌酒之間的差異。使用SIEVE軟件對(duì)樣品2263（12年）、2264（18年）、和2265（未標(biāo)明年份，但已知是在三個(gè)不同的酒桶中進(jìn)行過(guò)陳化）的重復(fù)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，PCA結(jié)果顯示這三份樣品間存在明顯差異，而重復(fù)進(jìn)樣分析的結(jié)果則一致（圖8）。

在TraceFinder軟件中能夠迅速分離出造成這些差異的化合物：通過(guò)用熱圖形式展示解卷積化的譜峰列表（圖9），樣品間峰高的差異一目了然，可以輕松挑選出研究者感興趣的譜峰。

TraceFinder根據(jù)譜圖匹配和質(zhì)量對(duì)推測(cè)的化合物列表進(jìn)行排列，鑒定結(jié)果為羥甲基呋喃醛（圖10）。具體來(lái)說(shuō)就是該軟件先根據(jù)推測(cè)化合物結(jié)構(gòu)能夠在質(zhì)量層面解釋多少譜圖內(nèi)容進(jìn)行評(píng)分，當(dāng)搜索指數(shù)（> 600），后按這兩個(gè)參數(shù)排序找到吻合的結(jié)果。威士忌酒中出現(xiàn)羥甲基呋喃醛（HMF）并不令人意外，因?yàn)樵摶衔锸翘敲撍漠a(chǎn)物。6，7樣品2265曾在三個(gè)不同的酒桶中進(jìn)行陳化，其中包括曾釀過(guò)高糖分的雪莉酒和波本威士忌的酒桶，因此其中羥甲基呋喃醛濃度高企很可能是由于威士忌酒與酒桶內(nèi)表面相互作用造成的。尤其是已知波本威士忌橡木酒桶的受熱碳化會(huì)導(dǎo)致HMF濃度的升高。

結(jié)論

驗(yàn)證性研究的結(jié)果顯示，使用Thermo Scienti?c Q ExactiveGC混合四極桿-Orbitrap質(zhì)譜儀與TraceFinder和SIEVE 2.2軟件組合能夠非常有效地對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行化學(xué)輪廓描繪分析。Orbitrap質(zhì)譜儀能夠?qū)崿F(xiàn)樣品中所有組分的高質(zhì)量準(zhǔn)確度檢測(cè)，使得對(duì)樣品快速、可靠、不局限于組分濃度的表征成為可能。

•可靠、高度重復(fù)性的色譜分離與高速數(shù)據(jù)采集能力的組合使Q Exactive GC系統(tǒng)成為一個(gè)進(jìn)行復(fù)雜樣品化學(xué)輪廓分析的理想平臺(tái)。

•常規(guī)保證的60,000 FWHM分辨率與足夠?qū)挼亩縿?dòng)態(tài)范圍消除了質(zhì)量數(shù)相同（低分辨質(zhì)譜不能分辨）物質(zhì)干擾的煩惱，加之穩(wěn)定的1 ppm以?xún)?nèi)的質(zhì)量準(zhǔn)確度和的靈敏度，大大提高了復(fù)雜基質(zhì)中化合物鑒定結(jié)果的可靠度。

•SIEVE 2.2與TraceFinder軟件使得快速、全面的威士忌酒樣品表征易如反掌，化合物分離鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可信。

•EI和PCI數(shù)據(jù)可以用來(lái)搜索商用譜庫(kù)并進(jìn)行初步的化合物鑒定分析。而當(dāng)譜庫(kù)搜索無(wú)果時(shí)，準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)據(jù)也使得推測(cè)元素組成有根有據(jù)。而推測(cè)的鑒定結(jié)果也能夠在Mass Frontier7.0中根據(jù)碎片離子的準(zhǔn)確質(zhì)量快速進(jìn)行確認(rèn)或排除。

【儀器/耗材清單】

所有實(shí)驗(yàn)均使用賽默飛Q Exactive GC系統(tǒng)進(jìn)行。進(jìn)樣使用Thermo Scienti?cTM TriPlusTM RSH自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜分離使用ThermoScienti?cTMTriPlusTM1310 GC，搭配Thermo Scienti?cTM TraceGOLDTM TG-5SilMS 30 m×0.25 mm I.D.×0.25 µm薄層毛細(xì)管色譜，帶10 m預(yù)柱（P/N 26096-1425）。